背景[1][2]
克雷伯氏菌屬(Klebsiella)是腸桿菌科的一個(gè)屬，由革蘭氏陰性、不運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧、氧化酶陰性和具有莢膜、單個(gè)、成對(duì)或呈短鏈排列的直桿菌組成。其菌體大小為(0.3～ 1.0)μm×(0.6～6.0)μm。大多數(shù)菌株能利用檸檬酸鹽和葡萄糖，從葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵肌醇，水解尿素。本屬中肺炎克雷伯氏菌是革蘭氏陰性菌群體中引起肺炎最常見(jiàn)的病原菌。另外，也引起人的疾病，包括無(wú)癥狀的腸道、尿道或呼吸道中定植導(dǎo)致致死性菌血癥，因而是醫(yī)院病人重要的條件性致病菌。
該菌也能引起動(dòng)物的肺炎、胃腸道炎、尿道炎和乳房炎等。在家畜墊草和飲水中均能發(fā)現(xiàn)該菌的存在。肺炎克雷伯氏菌是人類呼吸道和腸道的常居菌，可引起下呼吸道、血液、泌尿道、消化道、手術(shù)切口、顱內(nèi)、皮膚軟組織等多個(gè)部位感染，是醫(yī)院感染及免疫缺陷者感染的重要病原菌。
近年來(lái)由于各種抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致肺炎克雷伯氏菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，其耐藥性可能與產(chǎn)生抗生素水解酶、生物被膜形成、外膜孔蛋白缺失、gyrA和parC基因變異、抗菌藥物主動(dòng)外排等機(jī)制有關(guān)。
毒理研究[2]
肺炎克雷伯菌是社區(qū)獲得性及醫(yī)院獲得性感染的常見(jiàn)病原體，可引起肺炎、膿毒癥等多種感染，近年來(lái)逐漸成為肝膿腫的主要病原菌。hvKP引起的肝膿腫，常合并肝外轉(zhuǎn)移病灶，如眼內(nèi)炎、腦膜炎等，其中并發(fā)腦膜炎患者的致死率較高。多種毒力因子在肺炎克雷伯菌引起肝膿腫的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，例如莢膜多糖、脂多糖、鐵攝取系統(tǒng)和菌毛等，但目前仍對(duì)某些毒力因子在致病過(guò)程中所起的作用不明確。
因此，對(duì)肺炎克雷伯菌的毒力因子進(jìn)行深入研究有利于了解并阻斷其致病過(guò)程，從而減少肝膿腫的發(fā)生，提高人群健康水平，減少社會(huì)醫(yī)療支出。隨著對(duì)肺炎克雷伯菌毒力因子作用的進(jìn)一步明確，有望實(shí)現(xiàn)早期檢出hvkP，幫助臨床醫(yī)生早發(fā)現(xiàn)、早診斷肝膿腫，并及早給予治療。
耐藥機(jī)制[3]
1. 肺炎克雷伯菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐藥機(jī)制
1)β-內(nèi)酰胺酶：β-內(nèi)酰胺酶中以超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的產(chǎn)生在肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制中最重要。肺炎克雷伯菌能產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，可以對(duì)包括第三代頭孢菌素在內(nèi)的多種抗生素產(chǎn)生耐藥，也是臨床上最容易產(chǎn)生ESBLs的菌種1983年，最先在德國(guó)發(fā)現(xiàn)1株臨床分離的肺炎克雷伯菌可以產(chǎn)生1種質(zhì)粒介導(dǎo)的p一內(nèi)酰胺酶，氨基酸序列分析顯示是由于SHV-1在238位點(diǎn)發(fā)生甘氨酸到絲氨酸的突變所致，這種酶稱為SHV-2。
隨后，在臨床分離出的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了SHV-5、SHv-l2、SHV-13、SHV-14、SHV-16、SHV-1 8、SHv25—27等SHV型ESBLs和TEM一4TEM一48、TEM.49等TEM型的ESBLs，目前已發(fā)現(xiàn)TEM型ESBLs約100種。而且TEM~LSHV型檢出率高，檢出最少的基因型是OXA。過(guò)去認(rèn)為肺炎克雷伯菌主要以產(chǎn)SHV、TEM型的ESBLs為主，但是近年來(lái)世界各地產(chǎn)CTX基因型的報(bào)道不斷增。CTX-M基因型的特點(diǎn)對(duì)舒巴坦和克拉維酸耐藥。
產(chǎn)ESBLs的CTX-M型主要對(duì)頭孢塞肟和頭孢曲松等具有較強(qiáng)的水解活性，產(chǎn)CTX-M15型ESBLs菌株對(duì)頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥性高于產(chǎn)CTX-M14型ESBLs菌株，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CTX-M 15型具有水解頭孢他啶的活性。201 5年在歐洲文獻(xiàn)報(bào)道CTX -M15型檢出率高于CTX-M 14型。根據(jù)20 15年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示，革蘭陰性桿菌中肺炎克雷伯菌排名第二，占臨床分離革蘭陰性桿菌菌株的19.8％。產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌分離菌株比例由2007年的16.35％ ，近年上升為56.09％，細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重。
2）頭孢菌素酶(AmpC)：AmpC酶是革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的又一類重要的β-內(nèi)酰胺酶，屬功能分類法的I組，分子分類法的C類，編碼AmpC酶的基因常發(fā)現(xiàn)在腸桿菌科，包括腸桿菌屬、志賀菌屬、普羅威登斯菌屬和大腸埃希菌屬的染色體上。
1988年美國(guó)Rhode島內(nèi)感染流行，從那些院內(nèi)患者中分離出1株肺炎克雷伯菌，此菌株產(chǎn)生的B一內(nèi)酰酶是有BushI類酶的生化特性，其基因與陰溝桿菌的染色體AmpC基因有90％同源性，對(duì)第二代頭孢菌素、頭酶素及酶抑制劑復(fù)合物均耐藥，且這種耐藥性可傳遞，后來(lái)被確認(rèn)為質(zhì)粒介導(dǎo)~AmpC酶。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶是繼ESBLs之后出現(xiàn)的革蘭陰性桿菌耐AmpC酶細(xì)菌對(duì)至三代頭孢菌素、頭霉素、氨曲南等耐藥，且不受臨床常用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦抑制的重要原因。
迄今AmpC酶已有40余種基因型，世界范圍內(nèi)以CMY-2型多見(jiàn)，國(guó)內(nèi)主要為DHA.1型~BACT-1型。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AmpC酶不僅由染色體介導(dǎo)，也可由質(zhì)粒介導(dǎo)，且質(zhì)粒介導(dǎo)者因其具有較快的傳播速度和較強(qiáng)的耐藥性，質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生頭孢菌素類以及碳青霉烯類多藥耐藥的重要原因。產(chǎn)酶株可以對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥，耐藥菌株的質(zhì)粒攜帶耐藥基因能夠在菌株間迅速傳播擴(kuò)散。
3）碳青霉烯酶：碳青霉烯類抗生素是具有廣譜抗菌活性的β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶類抗生素，具有抗頭孢菌素誘導(dǎo)酶、抗TEM和SHV型超廣譜酶等優(yōu)點(diǎn)，是治療效果比較理想的抗感染藥。由于臨床廣泛濫用，目前己出現(xiàn)了能水解碳青霉烯類的β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶。肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素敏感性下降的最主要原因是產(chǎn)碳青霉烯酶。
它的催化基團(tuán)活性部位均含絲氨酸殘基，可以被克拉維酸和他唑巴坦抑制。Ambler分類法根據(jù)氨基酸序列的相似性將β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶分為A、B、C、D4類，其中A、B、D類中具有水解碳青霉烯類活性的酶被稱為碳青霉烯酶。A類KPC酶世界各地都有報(bào)道，B類和D類主要存在于醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的多重耐藥菌株，C類很少有報(bào)道。
A類碳青霉烯酶主要有染色體編碼的SME、IMI和NMC以及質(zhì)粒編碼的KPC和GES型。在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的A類酶包括KPC型GES型及SHV-38型等。產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥最常見(jiàn)的機(jī)制，目前己知的KPC1—22(KPC.1和KPC.2被證實(shí)是同一種酶 ，在肺炎克雷伯菌以KPC.2和KPC一3較為常見(jiàn)，其中又以KPC一2基因型最容易引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行。B類碳青霉烯酶又稱金屬D一內(nèi)酰胺酶(MBL)，所有的金屬酶都含有至少1個(gè)鋅離子活性中心，其水解活性不被克拉維酸、舒巴坦等酶抑制劑抑制，但可以被乙二胺四乙酸(EDTA)及巰基化合物等金屬離子螯合劑所抑制。
目前在肺炎克雷伯菌中檢測(cè)到的金屬酶主要有IMP、VIM和NDM等類型。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的IMP酶共有38個(gè)類型，大多由IMP-1、IMP.2突變而來(lái)，同源性較高，主要通過(guò)I類整合子進(jìn)行水平傳播。VIM是所有類型金屬酶中對(duì)碳青霉烯類的水解能力最強(qiáng)的1種金屬酶。NDM-1是一種新的超級(jí)耐藥基因，編碼1種新的耐藥酶，稱為NDM-1金屬β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶。
2009年在印度新德里發(fā)現(xiàn)了1種超級(jí)細(xì)菌NDM-1，即新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶1，從南亞傳入英國(guó)，很可能向全世界蔓延。NDM-1是ndm基因編碼的產(chǎn)物，能水解幾乎所有的B一內(nèi)酰胺類抗菌藥物，病菌變得無(wú)比強(qiáng)大，幾乎所有抗生素都失效。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于大腸埃希菌屬的NDM包括NDM-1、NDM-3、NDM-4、NDM-5、NDM-6、NDM-7、NDM-8。
2014年中國(guó)蘇州報(bào)道從肺炎克雷伯菌發(fā)現(xiàn)NDM-5基因。D類碳青霉烯酶又稱苯唑西林酶(OXA酶)，大多對(duì)碳青霉烯類水解效率較低，不能水解氨曲南，常與其他耐藥機(jī)制協(xié)同導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類高度耐藥。目前發(fā)現(xiàn)的OXA酶有200多種，在肺炎克雷伯菌中檢出最多的為OxA.48。
肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥的最主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，而編碼碳青霉烯酶的基因大多通過(guò)可移動(dòng)質(zhì)粒介導(dǎo)，易引起菌株間耐藥基因的水平傳播，由于耐碳青霉烯類的KPC、VIM、NDM的出現(xiàn)導(dǎo)致泛耐菌株的出現(xiàn)，僅有多黏菌素、磷霉素、替加環(huán)素等幾種抗生素治療有效。超級(jí)細(xì)菌NDM基因的出現(xiàn)，可能導(dǎo)致醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，這應(yīng)當(dāng)引起醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。
2. 肺炎克雷伯菌外膜蛋白的缺失和靶位的改變產(chǎn)生的耐藥機(jī)制
1）外膜蛋白的缺失：克雷伯菌等革蘭陰性菌細(xì)胞外膜脂多層中存在由許多微孔蛋白組成的孔道，它是一種非特導(dǎo)性的、跨越細(xì)胞膜的水溶性擴(kuò)散通道，一些β-內(nèi)酰酶類抗生素可經(jīng)通道進(jìn)入菌體內(nèi)而發(fā)揮作用。一旦外膜孔蛋白缺失或減少就會(huì)影響抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量大減，導(dǎo)致耐藥。由于氨基糖甙等尚有其他通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所以外膜孔蛋白缺失造成的耐藥性主要與B一β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺類抗生素有關(guān)。
2）靶位的改變：肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮類耐藥主要是靶位的改變。喹諾酮類抗生素的作用靶位有DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶A，兩者均參與DNA的復(fù)制使得細(xì)菌無(wú)法復(fù)制而起抑菌作用。肺炎克雷伯菌主要的耐藥機(jī)制是藥物誘導(dǎo)的靶位點(diǎn)基因突變一染色體gyrA、gyrB基因的突變，該基因突變引起的耐藥被認(rèn)為不具有水平傳播性。隨著此類抗生素的過(guò)度應(yīng)用，耐藥菌不斷出現(xiàn)。在20世紀(jì)，細(xì)菌耐喹諾酮類藥物為DNA旋轉(zhuǎn)酶編碼基因f gyrA、gyrB、parC、parE)突變所致。其gyrA編碼基因第83、87位密碼子的突變是最常見(jiàn)的耐藥原因。
3. 肺炎克雷伯菌生物膜的耐藥機(jī)制
生物膜(bacterial biofilm)是細(xì)菌在群體生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的一種特定現(xiàn)象，是細(xì)菌由其分泌的含水聚合性基質(zhì)(主要是胞外多糖)黏附在物體或生物組織表面形成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落。研究發(fā)現(xiàn)，自然界中99％的細(xì)菌是以生物膜的形式存在，65％的人類細(xì)菌感染與生物膜形成有關(guān) 。細(xì)菌一旦形成生物膜后，相對(duì)于游離菌難以被殺滅和清除。隨著高科技的介入治療，許多醫(yī)用材料(如各種導(dǎo)管、人工關(guān)節(jié)、人工心臟瓣膜等)一旦被細(xì)菌黏附并形成生物膜，細(xì)菌污染不易消除，常導(dǎo)致感染遷延不愈。
4. 肺炎克雷伯菌外排泵的耐藥機(jī)制
細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)可分5大類：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族(ATP.binding cassete family，ABC)、主要易化因子超家族、藥物與代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族、DMT與之相關(guān)的小多藥外排家族、多藥物與毒物外排家族、耐受.生節(jié)一分裂家族RND類。盡管細(xì)菌耐藥主動(dòng)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體種類眾多，但是，目前研究顯示，RND類的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥性形成密切相關(guān)。
5. 肺炎克雷伯菌整合子的耐藥機(jī)制
有研究表明，整合子陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌株耐藥性比例高于整合子陰性的肺炎克雷伯菌。I類整合子陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷 、喹諾酮類及大多數(shù)B.內(nèi)酰胺類的耐藥率高于I類整合子陰性的菌株。肺炎克雷伯菌臨床分離株存在較廣，含有I類整合子的肺炎克雷伯菌更易獲得耐藥性。
主要參考資料
[1] 現(xiàn)代乳品工業(yè)手冊(cè)
[2] 引起肝膿腫的肺炎克雷伯菌毒力因子研究進(jìn)展
[3] 李瑞蓉, 崔雪萍. 肺炎克雷伯菌主要耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志, 2016, 4(2): 86-90.