背景^[1-3]

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人tPA抗體包被于酶標(biāo)板上，實驗時樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的人tPA會與包被抗體結(jié)合。后依次加入生物素化的抗人tPA抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，抗人tPA抗體與結(jié)合在包被抗體上的人tPA結(jié)合，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測OD值，tPA濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中tPA的濃度。

PLAT(tissue-type plasminogen activator)組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）是一種在纖維蛋白溶解過程中發(fā)揮重要作用的蛋白酶。在血液中，t-PA通過將纖溶酶原（plasminogen）轉(zhuǎn)化為纖溶酶（plasmin），促進血栓的溶解。t-PA主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成，與其功能相對的是纖溶酶抑制劑（plasminogen activator inhibitor，PAI），它可以抑制t-PA的活性。

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒樣品收集、處理及保存方法

1）血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2）血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3）細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4）組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

5）保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒試劑的準(zhǔn)備

1）標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。

2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒操作步驟

1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

3）加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8）取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9）在450nm波長處測定各孔的OD值。

應(yīng)用^[4][5]

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒可以用于組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）突變體乳腺特異性表達載體的構(gòu)建及其細(xì)胞表達研究

研究以山羊β-乳球蛋白基因調(diào)控區(qū)為指導(dǎo)元件,以人組織型纖溶酶原激活劑F、E、K1區(qū)及Asp 117糖基化位點缺失體為表達序列,構(gòu)建了乳腺特異性表達載體pBCrt-PA,轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞,篩選獲得穩(wěn)定表達細(xì)胞株。

應(yīng)用PCR法以實驗室保存的野生型t-PA cDNA為模板擴增出長度約1.1kb含K2和P區(qū)的t-PA部分序列。同時,合成一段長度為60bp的山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列。利用定向克隆法,將山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列插入到克隆載體pCEP4中。然后,將已擴增的t-PA cDNA序列定向克隆到山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列之后。再將含有CMV、山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列、t-PA以及SV40p(A)序列的基因片段,克隆到實驗室已有的通用乳腺特異性表達載體BnF95中,最終構(gòu)建了由山羊β-乳球蛋白基因5′、3′調(diào)控序列指導(dǎo)的t-PA cDNA突變體乳腺特異性表達載體pBCrt-PA。進一步用Sal I、Not I雙酶切pBCrt-PA回收大小約9.8kb的轉(zhuǎn)基因片段。通過電擊轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)基因片段導(dǎo)入體外培養(yǎng)的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞。經(jīng)G418篩選三周后得到62株抗G418的陽性細(xì)胞株。提取抗G418的陽性細(xì)胞株基因組DNA,經(jīng)PCR檢測初步確認(rèn)有22株細(xì)胞中整合了外源基因。用催乳素對PCR檢測陽性細(xì)胞株進行誘導(dǎo)表達,收集誘導(dǎo)表達48h后細(xì)胞上清進行人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒ELISA檢測。

人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)Elisa試劑盒檢測結(jié)果表明,有2株P(guān)CR檢測陽性細(xì)胞株可表達t-PA突變體,但表達量相對較低,其表達水平分別為5.98ng/ml和2.35ng/ml。對于表達產(chǎn)物的活性、半衰期檢測以及如何提高表達水平有待進一步研究。

參考文獻

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