背景^[1-3]

兔抗GSK3 BETA多克隆抗體是一類可以特異性結(jié)合GSK3 BETA的多克隆抗體，主要用于檢測GSK3 BETA的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。

檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中GSK3 BETA水平。用純化的GSK3 BETA抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入GSK3 BETA，再與HRP標(biāo)記的GSK3 BETA抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GSK3 BETA呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中GSK3 BETA濃度。

GSK-3β的生物學(xué)特性：GSK-3最早在兔骨骼肌的分次提取物中被分離出來，主要有兩種亞型，即GSK-3α和GSK-3β，二者在催化區(qū)域具有98%的同源性，于N-和C-末端略有不同。

糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種在進(jìn)化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，普遍存在于哺乳動物真核細(xì)胞中，除去最早發(fā)現(xiàn)的調(diào)控糖原合成酶(GS)的活性外，GSK-3β還能作用于眾多信號蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡.在癌癥神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)精神類疾病等多種重大疾病的研究中，選擇其作為治療靶點，受到越來越多研究者的重視。

GSK-3β是參與肝糖代謝的關(guān)鍵酶，通過磷酸化GS抑制其活性，降低肝糖的合成，使體內(nèi)血糖濃度升高，在胰島素信號通路中受控于胰島素，參與肝糖的合成代謝。同時，GSK-3β通過影響血液中葡萄糖的濃度，還可調(diào)控Bax/HKII的比例，進(jìn)而影響線粒體滲透性及細(xì)胞色素C的釋放，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

應(yīng)用^[4][5]

用于頸部降溫通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路減輕心肺復(fù)蘇后兔腦損傷及抑制凋亡的機(jī)制研究

研究PI3K/Akt/GSK3β信號通路在頸部降溫的調(diào)節(jié)作用，初步探討頸部降溫的腦保護(hù)作用是否與PI3K/Akt及GSK3β的磷酸化有關(guān)。

方法：健康雄性新西蘭家兔隨機(jī)分為5組，采用4min室顫模型。按照復(fù)蘇后4、9、24小時不同時間點再分別分成3個亞組

（1）假手術(shù)組：常規(guī)手術(shù)操作置管，不誘導(dǎo)CA，于術(shù)后30分鐘處死取標(biāo)本。（2）常溫復(fù)蘇組（normothermia theat NT組）：常規(guī)致顫復(fù)蘇并于4、9、24小時時間點處死動物取標(biāo)本。

（2）復(fù)蘇中降溫組（intra-arresttherapeutic hypothermia IATH組）：于心肺復(fù)蘇同時啟動頸部快速降溫，目標(biāo)腦溫為34℃，以后維持目標(biāo)腦溫至ROSC后4小時。于4、9、24小時時間點處死動物取標(biāo)本。

（3）復(fù)蘇中降溫+LY294002（LY294002組）：復(fù)蘇前20分鐘腦室注射LY294002，余同組3。

（4）復(fù)蘇后1小時降溫組（post-arrest therapeutic hypothermia PATH組），于心肺復(fù)蘇后1小時啟動頸部快速降溫，目標(biāo)腦溫為34℃，余同組3。LY294002溶于DMSO稀釋成10μM，在動物腦立體定位儀下在ROSC前20min前給予腦室內(nèi)注射，其余各組給予溶劑DMSO。動物分別4h、9h、24h過量麻醉處死，采集標(biāo)本，若復(fù)蘇失敗或在相應(yīng)時間點之前發(fā)生死亡的，該動物的實驗數(shù)據(jù)不錄用，另外進(jìn)行補(bǔ)充動物實驗，保證各組5只動物。

應(yīng)用Western blotting檢測Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、的蛋白表達(dá)，運用TUNEL等方法觀察各組組織凋亡變化。結(jié)果：與Sham組比較，常溫心肺復(fù)蘇組兔腦細(xì)胞胞質(zhì)中的Akt(Thr-308)磷酸化水平（P-AKT）和P-GSK3β在心肺復(fù)蘇后4、9、24小時明顯減低，并呈逐步減低趨勢(p<O．05)；

復(fù)蘇后即刻頸部降溫組P-AKT和P-GSK3β水平在心肺復(fù)蘇后4、9、24小時各時間點均較常溫復(fù)蘇組明顯增強(qiáng)(p<O.05)；復(fù)蘇后1小時降溫組的蛋白表達(dá)水平各時間點也較常溫復(fù)蘇組有增強(qiáng)(p<O.05)，但弱于復(fù)蘇后即刻頸部降溫組。

參考文獻(xiàn)

[1]Hypothermia-Induced Neuroprotection is Associated with Reduced Mitochondrial Membrane Permeability in a Swine Model of Cardiac Arrest[J].Ping Gong,Rong Hua,Yu Zhang,Hong Zhao,Ziren Tang,Xue Mei,Mingyue Zhang,Juan Cui,Chunsheng Li.Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism.2013(6)

[2]Ultrafast and Whole-Body Cooling With Total Liquid Ventilation Induces Favorable Neurological and Cardiac Outcomes After Cardiac Arrest in Rabbits[J].M.Chenoune,F.Lidouren,C.Adam,S.Pons,L.Darbera,P.Bruneval,B.Ghaleh,R.Zini,J.-L.Dubois-Randé,P.Carli,B.Vivien,J.-D.Ricard,A.Berdeaux,R.Tissier.Circulation.2011(8)

[3]State of the Art in Therapeutic Hypothermia[J].Joshua W.Lampe,Lance B.Becker.Annual Review of Medicine.2011

[4]Intra-Arrest Transnasal Evaporative Cooling:A Randomized,Prehospital,Multicenter Study(PRINCE:Pre-ROSC IntraNasal Cooling Effectiveness)[J].Circulation.2010(7)

[5]張浙.頸部降溫通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路減輕心肺復(fù)蘇后兔腦損傷及抑制凋亡的機(jī)制研究[D].第二軍醫(yī)大學(xué),2014.