背景^[1-3]

WIF1抗體是一種可以特異性結(jié)合WIF1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的WIF1蛋白。WIF1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

WIF1基因編碼的蛋白質(zhì)起到抑制WNT蛋白的作用，WNT蛋白是在胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用的細(xì)胞外信號(hào)分子。該蛋白質(zhì)包含一個(gè)WNT抑制因子（WIF）結(jié)構(gòu)域和五個(gè)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為參與中胚層分割。相關(guān)基因作為腫瘤抑制因子相關(guān)基因發(fā)揮作用，并且已發(fā)現(xiàn)在各種癌癥中具有表觀相關(guān)性遺傳沉默。

WIF1抗體

WIF1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（WIF1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(WIF1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

WIF1抗體可以用于WIF1在非小細(xì)胞肺癌臨床樣本中的表達(dá)及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究

研究WNT抑制因子1(WNT inhibitory factor 1,WIF1)在非小細(xì)胞肺癌臨床組織樣本中的表達(dá)情況,分析WIF1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系,在細(xì)胞水平研究WIF1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549侵襲、遷移的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。

方法：搜集非小細(xì)胞肺癌患者臨床組織樣本(癌組織和癌旁組織),利用Real-time PCR、WIF1抗體Western blot檢測(cè)臨床樣本中WIF1分別在m RNA和蛋白水平的表達(dá)情況,同時(shí)用TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,輔助驗(yàn)證臨床檢測(cè)結(jié)果。分析WIF1 m RNA表達(dá)與臨床病理、預(yù)后的關(guān)系。培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549,構(gòu)建WIF1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和或空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549,劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的影響,Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)β-catenin表達(dá),驗(yàn)證WIF1對(duì)wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。結(jié)果在研究發(fā)現(xiàn)WIF1 m RNA和蛋白的表達(dá)在癌組織中顯著低于癌旁組織(P<0.05)。同時(shí)TCGA共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)IF1在肺腺癌和肺鱗癌中表達(dá)量均顯著低于正常組(P<0.05)。肺癌患者中,WIF1抗體WIF1高表達(dá)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率和TNM分期都顯著低于WIFI低表達(dá)的患者,且其生存期顯著高于低表達(dá)組(P<0.05)。WIF1抗體過(guò)表達(dá)WIF1顯著抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并顯著下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物MMP-2和MMP-9的表達(dá)(P<0.05)。過(guò)表達(dá)WIF1顯著抑制了β-catenin和Myc蛋白表達(dá)(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

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