背景[1-3]
ICOS抗體是一種可以特異性結(jié)合ICOS的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的ICOS蛋白。ICOS抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。
誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激因子（ICOS，CD278）是一種激活性共刺激免疫檢查點(diǎn)，在活化的T細(xì)胞上表達(dá)?？烧T導(dǎo)T細(xì)胞的增殖、存活和分化，并調(diào)節(jié)多種T細(xì)胞功能。其配體ICOSL在抗原呈遞細(xì)胞和體細(xì)胞上表達(dá)，包括腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞。ICOS與其配體的結(jié)合觸發(fā)下游通路，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖和存活，ICOS可作為預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。
ICOS抗體
ICOS抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿(mǎn)tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。
3.轉(zhuǎn)膜與封閉
1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。
3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測(cè)
1）將膜和一抗（ICOS抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(ICOS抗體)。
3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應(yīng)用[4][5]
ICOS抗體可以用于狼瘡腎炎患者外周血淋巴細(xì)胞上ICOS/B7RP-1的表達(dá)及激素的影響
比較狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)患者、無(wú)腎臟損害的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者和正常對(duì)照外周血T、B淋巴細(xì)胞上ICOS/B7RP-1的表達(dá),分析ICOS/B7RP-1表達(dá)與臨床活動(dòng)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)以及激素對(duì)其表達(dá)的影響。
方法:病例來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕科和腎內(nèi)科門(mén)診及住院部,LN患者、非LN患者以性別、年齡匹配,同時(shí)抽取匹配的健康體檢者為健康對(duì)照,參照系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)量表設(shè)計(jì)調(diào)查問(wèn)卷,收集患者疾病活動(dòng)度情況和實(shí)驗(yàn)室資料。運(yùn)用ICOS抗體三色流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)LN患者、非LN患者和正常對(duì)照記憶性T淋巴細(xì)胞(CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+)上ICOS的表達(dá)及原始B細(xì)胞(CD19+CD27-)、記憶性B細(xì)胞(CD19+CD27+)、漿細(xì)胞(CD19+CD27++)上B7RP-1的表達(dá)。分離ICOS表達(dá)較高患者的外周血淋巴細(xì)胞,適量激素刺激培養(yǎng),判斷激素對(duì)ICOS/B7RP-1表達(dá)的影響。
ICOS抗體結(jié)果:LN患者和非LN患者CD4+CD45RO+T細(xì)胞和CD8+CD45RO+T細(xì)胞ICOS的表達(dá)均高于正常對(duì)照,LN患者ICOS表達(dá)高于非LN患者(CD4:F=28.10,P<0.05;CD8:F=20.87,P<0.05),但I(xiàn)COS的表達(dá)水平與SLEDAI關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD4:r=0.16,P>0.05;CD8:r=0.26,P>0.05)。LN患者和非LN患者漿細(xì)胞占B淋巴細(xì)胞比例較正常對(duì)照增加,且LN患者高于非LN患者(F=46.59,P<0.05);LN患者和非LN患者記憶性B淋巴細(xì)胞占B淋巴細(xì)胞比例低于正常對(duì)照,但LN患者與非LN患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.40,P<0.05);LN患者、非LN患者和正常對(duì)照三組原始B淋巴細(xì)胞占B淋巴細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LN患者和非LN患者B淋巴細(xì)胞B7RP-1表達(dá)均低于正常人,但LN患者和非LN患者B7RP-1表達(dá)差異無(wú)顯著性(F=30.02,P<0.05),B7RP-1的表達(dá)與SLEDAI關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.04 P>0.05)。激素刺激外周血淋巴細(xì)胞,CD4+CD45RO+和CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞上ICOS的表達(dá)降低(CD4:F=11.94,P<0.05;CD8:F=34.41,P<0.05),B淋巴細(xì)胞上B7RP-1的表達(dá)下降(F=16.12,P<0.05)。
參考文獻(xiàn)
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[2]Regulation of T:B cell interactions by the Inducible Costimulator molecule:Does ICOS“induce”disease?[J].Rebecca A.Shilling;;Hozefa S.Bandukwala;;Anne I.Sperling.Clinical Immunology,2006(1)
[3]Eminent role of ICOS costimulation for T cells interacting with plasmacytoid dendritic cells[J].MarkoJanke;Esther J.Witsch;Hans W.Mages;AndreasHutloff;Richard A.Kroczek.Immunology,2006(3)
[4]B cell abnormality and autoimmune disorders[J].Takeshi Tsubata.Autoimmunity,2005(5)
[5]陳國(guó)平.狼瘡腎炎患者外周血淋巴細(xì)胞上ICOS/B7RP-1的表達(dá)及激素的影響[D].安徽醫(yī)科大學(xué),2009.