背景[1-3]
HLA-G抗體是一種可以特異性結合HLA-G的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的HLA-G蛋白。HLA-G抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。
HLA-G抗體
HLA-G抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉膜與封閉
1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。
2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。
3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（HLA-G抗體按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(HLA-G抗體)。
3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應用[4][5]
HLA-G抗體可以用于人類白細胞抗原G在子癇前期發(fā)病中的作用機制研究
人類白細胞抗原G(Human leucocyte antigen-G,HLA-G)是EVT表達的一種I類HLA分子,HLA-G通過與其免疫抑制性受體相互作用來介導免疫抑制。已知的HLA-G的免疫抑制性受體包括白細胞免疫球蛋白樣受體B1(Leukocyte immunoglobulin-like subfamily B member 1,LILRB1)、白細胞免疫球蛋白樣受體B2和KIR2DL4。這些受體由母胎界面的免疫細胞表達,其中蛻膜自然殺傷細胞(Decidual natural killer cells,d NK)是母胎界面最豐富的淋巴細胞群。
探討HLA-G與d NK細胞上的抑制性受體LILRB1作用后對EVT侵襲產生的影響,并探究可能的分子機制,以期闡明HLA-G在PE的發(fā)病中的作用及機制。
方法:1.收取PE和正常妊娠晚孕期蛻膜組織各20例,采用HLA-G抗體免疫組化法和實時熒光定量PCR法檢測PE蛻膜組織與正常妊娠蛻膜組織中HLA-G表達水平差異。2.收取早孕期蛻膜組織11例,采用流式細胞術從早孕期蛻膜組織中分選出d NK細胞;采用Transwell體系將分選出的d NK細胞與HTR-8/Svneo細胞共培養(yǎng)24h,按照干預方式和培養(yǎng)方式進行分組:(1)anti-LILRB1組:同時加入anti-LILRB1抗體和anti-HLA-G抗體;(2)anti-HLA-G組:只加入anti-HLA-G抗體;(3)HLA-G組:不使用抗體(anti-LILRB1抗體和anti-HLA-G抗體)干預;(4)d NK組:d NK細胞單獨培養(yǎng),此組作為對照。3.采用酶聯免疫吸附法檢測各組d NK細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子表達差異;4.采用蛋白質免疫印跡法檢測不同組別d NK細胞LILRB1表達差異;5.采用Transwell法檢測與d NK細胞共培養(yǎng)24h后的各組HTR-8/Svneo細胞的侵襲能力。
HLA-G抗體結果:1.PE蛻膜組織中HLA-G表達水平顯著低于正常妊娠蛻膜組織(P<0.001)。2.當LILRB1被抗體阻斷時,d NK細胞表達Ang-2、GM-CSF、IFN-γ、IL-8、IP-10和VEGF-C水平顯著降低;當HLA-G被抗體阻斷時,d NK細胞表達Ang-2、GMCSF、IL-8、IP-10和VEGF-C水平明顯降低,同時表達IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)。3.anti-HLA-G組表達LILRB1水平顯著低于HLA-G組和d NK組(P<0.05)。4.anti-LILRB1組HTR-8/Svneo細胞侵襲能力顯著弱于anti-HLA-G組和HLA-G組;HLA-G組HTR-8/Svneo細胞侵襲能力顯著強于anti-LILRB1組和anti-HLA-G組;anti-HLA-G組HTR-8/Svneo細胞侵襲能力強于anti-LILRB1組弱于HLA-G組(P<0.0001)。結論:HLA-G在PE蛻膜中低表達。HLA-G可與d NK細胞上的抑制性受體LILRB1結合并上調d NK細胞上LILRB1的表達,HLA-G/LILRB1通路可調控d NK細胞表達相關細胞因子影響EVT侵襲。HLA-G低表達導致EVT侵襲能力減弱可能是PE發(fā)病的重要機制。
參考文獻
[1]HLA-G and HLA-E Immune Checkpoints Are Widely Expressed in Ewing Sarcoma but Have Limited Functional Impact on the Effector Functions of Antigen-Specific CAR T Cells[J].Altvater Bianca;Kailayangiri Sareetha;Pérez Lanuza Lina F.;Urban Katja;Greune Lea;Flügge Maike;Meltzer Jutta;Farwick Nicole;K?nig Simone;G?rlich Dennis;Hartmann Wolfgang;Rossig Claudia.Cancers.2021
[2]Decidual Natural Killer Cells:A Good Nanny at the Maternal-Fetal Interface During Early Pregnancy[J].Liu Yuefang;Gao Shujun;Zhao Yangjing;Wang Hui;Pan Qiong;Shao Qixiang.Frontiers in Immunology.2021
[3]Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.[J].Shmeleva Evgeniya V;Colucci Francesco.Mucosal immunology.2021
[4]A possible role for HLA-G in development of uteroplacental acute atherosis in preeclampsia[J].Johnsen Guro M.;Fjeldstad Heidi E.S.;Drabbels Jos J.M.;Haasnoot Geert W.;Eikmans Michael;St?rvold Gro L.;Alnaes-Katjavivi Patji;Jacobsen Daniel P.;Scherjon Sicco A.;Redman Christopher W.G.;Claas Frans H.J.;Staff Anne Cathrine.Journal of Reproductive Immunology.2021
[5]孫麗娜.人類白細胞抗原G在子癇前期發(fā)病中的作用機制研究[D].山東中醫(yī)藥大學,2022.