背景及概述^[1-2]

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重要代謝中間體，1952年首先由Cantoni發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量399。SAM是雙手性物質(zhì)，具有2種異構(gòu)體：(R，S)-SAM和(S，S)-SAM，只有(S，S)-SAM具有生物活性。由于SAM含有一個(gè)能激活相鄰碳原子的親核攻擊反應(yīng)的高能锍原子，因而具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基、轉(zhuǎn)氨丙基等作用。SAM參與了體內(nèi)40多種生化反應(yīng)，與蛋白質(zhì)、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、磷脂質(zhì)和維生素的合成密切相關(guān)，并連接多胺和谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化。

在歐洲，SAM已作為處方藥廣泛用于肝病、抑郁癥、關(guān)節(jié)炎等疾病的治療；在美國，已經(jīng)成為一種暢銷的保健品；在我國，SAM制備方法的研究盡管進(jìn)行了20年，但因技術(shù)水平較低、成本過高仍未能產(chǎn)業(yè)化。目前國內(nèi)使用的SAM主要是德國基諾(Knoll)和意大利RADIUMFARMAS.R.L.(IT)兩個(gè)外資公司的產(chǎn)品，其價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能普及使用。我國有眾多的肝炎、關(guān)節(jié)炎以及抑郁癥患者，SAM的需求量也將不斷增長，產(chǎn)品的市場開發(fā)前景廣闊。

隨著SAM需求量的日益增大，建立廉價(jià)有效的SAM生產(chǎn)工藝是其大規(guī)模推廣應(yīng)用的關(guān)鍵，因此有關(guān)SAM的制備方法成為研究熱點(diǎn)。SAM的制備始于20世紀(jì)50年代，目前主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、體外酶促合成法以及全細(xì)胞催化法。

功能^[1-2]

SAM幾乎在所有細(xì)胞的體內(nèi)代謝中發(fā)揮核心作用，如圖所示：

它主要作為三種代謝途徑的前體：轉(zhuǎn)甲基作用和轉(zhuǎn)硫基作用、轉(zhuǎn)氨丙基作用。

1）轉(zhuǎn)甲基作用

在細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)甲基化反應(yīng)中，SAM作為惟一的甲基供體發(fā)揮著重要的生理作用。許多細(xì)胞含有大量的專一性SAM轉(zhuǎn)甲基酶，可將SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到硫、氮、碳、氧原子上，參與體內(nèi)物質(zhì)的合成與代謝。例如：轉(zhuǎn)甲基酶將SAM的甲基轉(zhuǎn)移給氨基乙酸，則形成肌氨酸；甲基轉(zhuǎn)移給磷脂酰乙醇胺形成卵磷脂；甲基轉(zhuǎn)移給去甲腎上腺素形成腎上腺素。SAM脫去甲基后生成S-腺苷高半胱氨酸(SAH)，SAH是轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)的競爭性抑制劑，其只能在甲基循環(huán)中生成，不能通過任何食物來源獲得，是SAM代謝的重要分支點(diǎn)。

2）轉(zhuǎn)硫基作用

SAM通過轉(zhuǎn)甲基作用形成的S-腺苷高半胱氨酸，在體內(nèi)迅速被代謝為高半胱氨酸。胱硫醚合成酶催化高半胱氨酸和絲氨酸作用生成胱硫醚，胱硫醚通過一系列代謝，生成谷胱甘肽(GSH)，GSH是細(xì)胞主要的抗氧化劑，可有效防止肝損傷。

3）轉(zhuǎn)氨丙基作用

SAM在聚胺合成中起重要作用，SAM脫羧后生成5′-腺苷甲基硫丙胺，將此物質(zhì)中的氨丙基轉(zhuǎn)移給腐胺，從而生成亞精胺和精胺，它們是真核生物中重要的多胺。5′-腺苷甲基硫丙胺脫去氨丙基后生成5′-甲硫腺苷，其在體內(nèi)被迅速轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸。

藥理作用^[1-2]

慢性肝病的發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生過量活性氧族有關(guān)。在藥物(如酒精、CCl4、對苯乙酰胺、D-半乳糖胺等)刺激或病理?xiàng)l件下，肝臟線粒體產(chǎn)生過量的活性氧族(包括超氧化物陰離子、組織過氧化物和自由基等)?；钚匝踝逡环矫嫜趸麅?nèi)含巰基的酶和蛋白，導(dǎo)致其次級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，使其喪失催化功能及生物活性；另一方面促進(jìn)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用并促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡成分的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

病理?xiàng)l件下，人體內(nèi)的非酶系抗過氧化物(主要是GSH)大量耗竭，通過補(bǔ)給外源性SAMe，肝內(nèi)谷胱甘肽(GS)、還原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)上升，解除肝內(nèi)氧化物應(yīng)激狀態(tài)，達(dá)到治療肝病的目的。膽汁的形成、運(yùn)輸、清除需要大量竇狀、管狀肝細(xì)胞參與，這些肝細(xì)胞膜內(nèi)嵌有負(fù)責(zé)膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)、合成以及形成通道或受體的蛋白。肝細(xì)胞受損導(dǎo)致膽汁淤積。

試驗(yàn)證明，使用了CyA后，肝細(xì)胞膜流動(dòng)性、膜磷脂含量、磷脂酰膽堿/磷脂酰乙醇胺、Na+/K+ATPase活性降低。而將CyA和SAMe合并給藥時(shí)，SAMe能消除上述CyA產(chǎn)生的影響，改善膽汁淤積的各項(xiàng)生化指標(biāo)。這是因?yàn)镾AMe水平升高，能促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂酰乙醇胺甲基化生成磷脂酰膽堿(卵磷脂)，使細(xì)胞膜流動(dòng)性增加，從而提高Na+/K+ATPase活性，促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

SAMe治療抑郁癥的確切機(jī)制還不清楚，但有大量的事實(shí)表明，葉酸、維生素B12不足將使中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)SAMe含量降低，誘發(fā)神經(jīng)性及精神性疾病。研究者發(fā)現(xiàn)，色氨酸羥化酶是兒茶酚胺合成中的限速酶。在體外試驗(yàn)中，色氨酸羥化酶能被SAMe激活，被SAH抑制。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究還表明，SAMe具有β受體阻斷劑樣作用。

給大鼠使用SAMe一個(gè)星期后，腦細(xì)胞膜上β受體數(shù)量增加，α受體與去甲腎上腺素親和力降低。與青年鼠相比，老齡鼠腦細(xì)胞膜與β受體激動(dòng)劑結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量減少，長期給服SAMe能增加結(jié)合位點(diǎn)。多巴胺受體激動(dòng)劑與膜的結(jié)合不受外源性SAMe影響，但多巴胺敏感性腺苷環(huán)化酶活性(在老齡鼠腦內(nèi)降低)恢復(fù)正常。這可能與膜甲基化作用有關(guān)：膜流動(dòng)性增加，使得β受體-腺苷環(huán)化酶偶聯(lián)更加有效。

近來研究表明，SAMe對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)與分泌也有抑制作用。TNF-α是一種多向炎性細(xì)胞因子，在肝臟受損的過程中起重要的介導(dǎo)作用。在脂多糖誘導(dǎo)TNF-α過量表達(dá)的大鼠模型中，SAMe能明顯降低血清TNF-α的含量。進(jìn)一步研究表明，SAMe能降低TNF-α的釋放以及穩(wěn)定態(tài)TNF-αmRNA的含量。研究還發(fā)現(xiàn)，血漿中同型半胱氨酸的升高是血管疾病的危險(xiǎn)信號(hào)，且冠狀動(dòng)脈疾病患者血漿SAMe含量低于正常水平。給健康志愿者口服SAMe腸溶片以后，受試者血漿5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)水平升高，5-MTHF能使同型半胱氨酸重新甲基化生成甲硫氨酸，增強(qiáng)同型半胱氨酸的代謝，可用于預(yù)防血管疾病.

臨床應(yīng)用^[1-2]

1）SAM在治療肝病中的應(yīng)用

肝臟是SAM合成和甲基化的主要場所，如果肝臟受到損傷，肝病患者的SAM合成被阻斷，蛋白質(zhì)和核酸的合成、聚胺和半胱氨酸的供給都會(huì)受到限制。半胱氨酸是一種重要的肝臟保護(hù)劑谷胱甘肽的合成前體。臨床研究證明，注射和口服SAM可以有效提高血液和肝組織中谷胱甘肽的含量，從而提高肝臟的解毒作用，可以減輕甚至消除肝臟損傷，SAM對膽汁淤積、酒精造成的肝損傷包括肝硬化及其它一些肝功能紊亂都有療效，尤其對肝硬化有較好的臨床效果，可以顯著降低其死亡率。

2）SAM在治療抑郁癥中的應(yīng)用

早在1973年，就有研究表明SAM具有治療抑郁癥的作用，20世紀(jì)80年代，SAM在歐洲被用于治療抑郁癥。SAM是腦內(nèi)主要的甲基供體，參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成。由于它的轉(zhuǎn)甲基功能，可以促進(jìn)腦內(nèi)多巴胺、血液中復(fù)合胺的代謝，磷脂的甲基化有助于增強(qiáng)受體功能、增加受體的密度和改善受體耦合作用。

臨床研究證明，每天注射或口服200~1600mgSAM可以有效的緩解抑郁癥，其療效比安慰劑要好，與標(biāo)準(zhǔn)三環(huán)類抗抑郁劑相當(dāng)。SAM對各種抑郁癥，尤其是產(chǎn)后抑郁癥有特殊療效，而且較其它同類藥物有見效快、無成癮性、幾無不良反應(yīng)以及耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，通常在一周內(nèi)癥狀就會(huì)明顯改善，可用于治療對其它抗抑郁藥物耐受性差的患者、老年患者、患有嚴(yán)重肝臟疾病者的抑郁癥患者等。

3）SAM在治療骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

SAM具有消炎、減輕疼痛及組織修復(fù)功能。研究表明，SAM與目前治療關(guān)節(jié)炎的首選藥布洛芬和萘普生療效相當(dāng)，具有明顯促進(jìn)軟骨生成和減輕關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和腫脹的功效，副作用少、見效快。早在20世紀(jì)70年代，歐洲就已經(jīng)將SAM作為治療關(guān)節(jié)炎的處方藥使用。

制備^[3]

1. 化學(xué)合成法

目前，化學(xué)合成法制備SAM主要有3條途徑：①利用5′-甲硫腺苷和DL-2-氨基-4-溴丁基酸化學(xué)合成消旋的SAM，合成的SAM有50%具有生物活性；②通過S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine，SAH)和甲基供體CH3I或(CH3)3S催化合成，反應(yīng)底物SAH價(jià)格昂貴，而且產(chǎn)物中含有20%～30%沒有生物活性的(R，S)-SAM異構(gòu)體；③以價(jià)格低廉的腺苷(Adenosine)為底物和亞硫酰氯進(jìn)行反應(yīng)制備5-(氯甲基)腺苷鹽酸(5′-Chloromethyladenosinehydrochloride)；以L-甲硫氨酸為底物在-30～-40℃的條件下生成L-同型半胱氨酸(L-Homocysteine)；以5-(氯甲基)腺苷鹽酸鹽和L-同型半胱氨酸為底物在70～80℃的條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)得到S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)；以三甲基氧鎓四氟硼酸鹽為甲基供體對SAH進(jìn)行甲基化得到終產(chǎn)物SAM。

盡管該方法原料價(jià)格低廉，但是反應(yīng)過程復(fù)雜、反應(yīng)溫度極端、反應(yīng)周期長，并且反應(yīng)產(chǎn)物僅有60%～65%具有生物活性。由于化學(xué)法合成SAM存在產(chǎn)率低、反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)產(chǎn)物異構(gòu)體多、分離純化困難以及環(huán)境污染等不足，現(xiàn)已很少使用。

2. 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是20世紀(jì)60年代至今工業(yè)化生產(chǎn)SAM的主要途徑。一些微生物尤其是酵母屬(Saccharomyces)的菌株，在含有L-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中生長時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)積累較高濃度的SAM。通過這些微生物的大規(guī)模發(fā)酵及提取精制，可獲得有生物活性的SAM。

1）天然菌株發(fā)酵生產(chǎn)SAM

考察了培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對釀酒酵母SAM-04-1發(fā)酵生產(chǎn)SAM的影響。結(jié)果表明，在5L發(fā)酵罐中間歇培養(yǎng)24h后，一次性補(bǔ)加24g·L-1葡萄糖和1.0g·L-1L-甲硫氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)24h后SAM產(chǎn)量可達(dá)2.66g·L-1

2）重組菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM

為了解決野生菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM產(chǎn)量較低的問題，通過基因工程技術(shù)以及代謝調(diào)控來有效提高SAM的產(chǎn)量得到了廣泛應(yīng)用。對于生產(chǎn)SAM菌株的遺傳改造主要有以下4種途徑：

A：通過高效表達(dá)釀酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2來提高細(xì)胞內(nèi)SAM合成酶的活性，從而提高SAM的產(chǎn)量。來源于釀酒酵母的SAM合成酶基因SAM2置于醇氧化酶1啟動(dòng)子(AOX1)的調(diào)控下，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，在搖瓶中考察了甲醇添加量對SAM產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，添加2%甲醇時(shí)，SAM最高產(chǎn)量為1.29g·L-1；添加0.6%甲醇時(shí)，在3.7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)約96h后，SAM產(chǎn)量達(dá)到8.66g·L-1。

B：敲除胱硫醚β-合酶(CBS)基因，阻斷SAM和甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，增加細(xì)胞內(nèi)SAM的積累。在畢赤酵母GS115中表達(dá)了腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2，同時(shí)敲除畢赤酵母中SAM分解代謝途徑的CBS基因，使重組菌SAM產(chǎn)量比原始菌株提高了56倍，在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)約100h后SAM產(chǎn)量達(dá)到13.5g·L-1。

C：解除SAM對甲叉四氫葉酸還原酶(MTHER)的反饋抑制，提高SAM的細(xì)胞內(nèi)積累量。釀酒酵母MTHER有2個(gè)同功酶Met12p和Met13p，研究表明在酵母細(xì)胞MTHER中Met13p同功酶是其活性的主要來源，催化5，10-甲叉四氫葉(CH2-THF)生成5-甲基四氫葉酸(CH3-THF)。CH3-THF是甲硫氨酸合成的甲基供體，而甲氨酸是SAM合成的前體，同時(shí)SAM對MTHER具有反饋抑制效應(yīng)。因此，如果能解除SAM對MTHER的反饋抑制，酵母細(xì)胞中SAM以及甲硫氨酸的含量將大幅提高。

D：構(gòu)建能將SAM分泌至培養(yǎng)液中的重組大腸桿菌。大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM與酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。首先，大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM的周期短(24h)，而酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM的周期一般超過100h；其次，大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的SAM可以分泌到培養(yǎng)基中，從而簡化了SAM純化方法，提高了SAM產(chǎn)率。

3.酶促合成法

酶促合成法是利用SAM合成酶催化底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP生成SAM，且SAM合成酶有三磷酸酶活性，將三磷酸分解為焦磷酸和磷酸，酶促反應(yīng)如下：

主要參考資料

[1] S-腺苷甲硫氨酸的臨床及藥理研究進(jìn)展

[2] S-腺苷甲硫氨酸的研究進(jìn)展

[3] S-腺苷甲硫氨酸制備方法的研究進(jìn)展