背景
你還記得次看到螢火蟲(chóng)的時(shí)候嗎？螢火蟲(chóng)那種酷炫的黃色光線是由熒光素酶(luciferase)產(chǎn)生的。[1]螢火蟲(chóng)發(fā)光產(chǎn)生光線并非易事，需要消耗大量能量——一個(gè)綠光子所需的能量約等于分解八個(gè)ATP分子所耗費(fèi)的能量。因此，熒光素酶使用了一種非常高能的過(guò)程來(lái)產(chǎn)生光。它有一個(gè)輔因子，被稱為熒光素(luciferin)，它與氧形成高度緊張的復(fù)合物，使用ATP分子來(lái)輔助一切。當(dāng)這個(gè)富氧熒光素在斷裂的過(guò)程中形成二氧化碳，留下一個(gè)高度激發(fā)的形式，然后發(fā)出光線。[2]
圖1 Firefly luciferase with the chromophore in yellow [2]
這種天然熒光素酶的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科學(xué)家們的興趣，他們開(kāi)始著手從螢火蟲(chóng)中提取和研究這種酶。隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)熒光素酶具有很高的特異性和敏感性，可以被檢測(cè)出非常微小的熒光素濃度。這種特性使得熒光素酶成為了生物技術(shù)領(lǐng)域中重要的標(biāo)記物和檢測(cè)工具，被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)相互作用等領(lǐng)域。
此外，熒光素酶還可以與其他蛋白質(zhì)或化合物結(jié)合形成復(fù)合物，從而發(fā)揮更加復(fù)雜的功能。例如，熒光素酶可以與一種名為“GFP”的綠色熒光蛋白結(jié)合，形成高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，被廣泛用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的定位和動(dòng)態(tài)變化。
相關(guān)研究
螢火蟲(chóng)熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在的條件下，催化熒光素氧化，產(chǎn)生黃綠色光。
圖2 熒光素酶催化熒光素氧化發(fā)光（來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）
值得注意的是，熒光素酶發(fā)出的光的顏色高度依賴于包圍熒光素的氨基酸。圖3（左邊）是來(lái)自日本螢火蟲(chóng)的熒光素酶的結(jié)構(gòu)，它通常發(fā)出綠黃色的光。但是，如果將一個(gè)絲氨酸氨基酸改變?yōu)樘於彼岚被?，光的顏色就?huì)變?yōu)榧t色，如圖3（右邊）所示。令人驚訝的是，這種變化離熒光素還有一定的距離，顏色變化被認(rèn)為是由于氨基酸包裝的細(xì)微變化和熒光素周?chē)撵`活性變化所導(dǎo)致的。[2]
圖3 the structure of luciferase [3]
2023年2月22日，華盛頓大學(xué)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)研究所David Baker教授團(tuán)隊(duì)在Nature上發(fā)表了研究論文De novo design of luciferases using deep learning，借助深度學(xué)習(xí)的“family-wide hallucination” 方法從頭設(shè)計(jì)出能特異性催化底物的熒光素酶LuxSit。這是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)領(lǐng)域的重要一步，從零開(kāi)始設(shè)計(jì)具有廣泛生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的高活性和特異性生物催化劑，也是計(jì)算酶設(shè)計(jì)的一個(gè)重要里程碑。[4]
圖4 Nature 論文截圖
iGEM相關(guān)研究
熒光素酶在生物感知、分子檢測(cè)等方面的應(yīng)用非常廣泛，許多iGEM團(tuán)隊(duì)都在利用熒光素酶進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。在iGEM的項(xiàng)目中，熒光素酶通常被用來(lái)標(biāo)記特定的蛋白質(zhì)、細(xì)胞或者基因，并且利用其熒光信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)其在生物體內(nèi)的分布和活動(dòng)狀態(tài)。
BBa_I712019 是2007年由Ljubljana團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)，該part來(lái)自螢火蟲(chóng)屬的熒光素酶。
2019年Munich 團(tuán)隊(duì)利用細(xì)胞可滲透底物D-Luciferin，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)確定了野生型螢火蟲(chóng)熒光素酶BBa_I712019的平衡參數(shù)。該團(tuán)隊(duì)使用Gibson重組技術(shù)將BBa_I712019序列連接到一個(gè)在HEK293T細(xì)胞中優(yōu)化的CAG啟動(dòng)子控制的骨架上（BBa_K3113200）。在測(cè)序確認(rèn)后，將含有螢火蟲(chóng)熒光酶序列的質(zhì)粒（pCAG_FLuc）轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。最后，使用不同的D-Luciferin濃度進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)，并測(cè)量發(fā)光度。結(jié)果觀察到了螢火蟲(chóng)熒光素酶與D-Luciferin的濃度存在相關(guān)性依賴性。
圖注：Luciferase Assay to determine equilibrium binding constant of the Firefly Luciferase and Luciferin. A dilution series of D-Luciferin was prepared reaching final concentrations from 0 μM up to 4 mM of D-Luciferin and luminescence was measured for ~8h.
圖注：The various D-Luciferin concentrations used throughout the luciferase assay were plotted against the averaged equilibrium values.[5]
除此之外，iGEM的parts還為大家提供了菱形珊瑚的熒光素2-單加氧酶（BBa_J52008）[6]。
參考資料
[1] Nakatsu T, Ichiyama S, Hiratake J, Saldanha A, Kobashi N, Sakata K, Kato H. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 2006 Mar 16;440(7082):372-6. doi: 10.1038/nature04542. PMID: 16541080.
[2] https://pdb101.rcsb.org/motm/78
[3] Nakatsu T, Ichiyama S, Hiratake J, Saldanha A, Kobashi N, Sakata K, Kato H. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 2006 Mar 16;440(7082):372-6. doi: 10.1038/nature04542. PMID: 16541080.
[4] Yeh AH, Norn C, Kipnis Y, Tischer D, Pellock SJ, Evans D, Ma P, Lee GR, Zhang JZ, Anishchenko I, Coventry B, Cao L, Dauparas J, Halabiya S, DeWitt M, Carter L, Houk KN, Baker D. De novo design of luciferases using deep learning. Nature. 2023 Feb;614(7949):774-780. doi: 10.1038/s41586-023-05696-3. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36813896; PMCID: PMC9946828.
[5] http://parts.igem.org/Part:BBa_I712019
[6] http://parts.igem.org/Part:BBa_J52008