背景

本發(fā)明涉及水解角蛋白的方法，該方法包括將固態(tài)角蛋白物質(zhì)在含有亞硫酸根離子的水溶液中進(jìn)行預(yù)處理以形成變性的角蛋白，并用蛋白酶進(jìn)行水解以形成角蛋白水解物。本發(fā)明中所述的含有角蛋白的物質(zhì)是指羽毛，頭發(fā)，羊毛，鬃毛、馬鬃、觸須，分趾蹄，和蹄。從工業(yè)意義上說(shuō)，這些物質(zhì)中的大多數(shù)，如羽毛和頭發(fā)，其本身幾乎是沒(méi)有利用價(jià)值的，并且雖然在自然界中它們也可被分解，但如果這樣大批量地浪費(fèi)也是一個(gè)問(wèn)題。

利用本發(fā)明的方法，可將角蛋白水解成動(dòng)物能夠利用的水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物中富含用作飼料的蛋白。

利用水解物可以生產(chǎn)給定長(zhǎng)度的寡聚肽，它可以用作化妝品成分尤其是用于處理和清洗皮膚和頭發(fā)。

人們知道，如果用物理方法進(jìn)行處理，就是說(shuō)，加熱，例如在146℃，345kpa壓力下加熱30到70分鐘可以促進(jìn)含有角蛋白的副產(chǎn)品，如羽毛和頭發(fā)的水解和軟化。這個(gè)被稱(chēng)為變性的過(guò)程可引起角蛋白結(jié)構(gòu)的變化，使提供給角蛋白化學(xué)性持久結(jié)構(gòu)的硫橋鍵打開(kāi)，靠酶（包括動(dòng)物的消化酶）的作用可將已變性的角蛋白水解成可利用的更小的成分即肽。

該分法的弊端是部分損毀了某些氨基酸并產(chǎn)生了人造氨基酸如：羊毛硫氨酸，從而降低了所制造的產(chǎn)品的質(zhì)量。

另一方面，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知利用化學(xué)處理也可以打開(kāi)硫橋鍵并且將蛋白質(zhì)切成小的成分就是說(shuō)，切割成肽。在≤2.0～4.0pH，沸點(diǎn)溫度時(shí)處理角蛋白2～20小時(shí)可打開(kāi)角蛋白的硫橋鍵并將蛋白質(zhì)分解成多肽，寡聚肽，甚至游離氨基酸。

同樣地，在強(qiáng)堿性范圍，沸點(diǎn)溫度或更高溫度時(shí)處理2小時(shí)以上產(chǎn)生如上所述的同樣結(jié)果。

化學(xué)處理的弊端是部分或甚至全部損毀某些氨基酸并且在水解物中產(chǎn)生極不均勻大小的肽?；瘜W(xué)水解，尤其是在堿性條件下，產(chǎn)生可能是具有毒副作用的人造氨基酸，羊毛硫氨酸和賴(lài)氨基丙氨酸（Lysinoalanine）。

借助在溫和條件下進(jìn)行的角蛋白的酶促水解和必要的預(yù)處理兩種方法，可獲得上面描述的方法所沒(méi)有的許多優(yōu)點(diǎn)。

酶促水解要求變性的角蛋白，就是說(shuō)，天然角蛋白經(jīng)過(guò)這種處理其中所有或只有一部分硫橋打開(kāi)，從而使蛋白水解酶或角蛋白水解酶能水解角蛋白中的肽鍵并將它分解成肽。

預(yù)處理即變性可以用上文中描述的物理方法即熱處理，或在酸性或堿性條件下的化學(xué)方法進(jìn)行，或者是在更溫和條件下采用與水解相結(jié)合的其他化學(xué)方法。

在德國(guó)專(zhuān)利NO.2705669中描述的角蛋白酶促水解反應(yīng)例子中，在水溶性混合物中處理頭發(fā)和羊毛，其量約為于物質(zhì)的7%，變性作用是在1.5到2.0pH，在≥80℃下至少進(jìn)行4小時(shí)。然后用水洗滌含有角蛋白的物質(zhì)即毛發(fā)和羊毛。

在另一個(gè)德國(guó)專(zhuān)利NO.3305305中，變性過(guò)程使用氧化亞硫酸分解法，其中角蛋白的胱氨酸與亞硫酸鹽形成角蛋白半胱氨酸磺酸鹽以及角蛋白半胱氨酸。在亞硫酸和硫代硫酸鹽，例如四硫代硫酸鹽存在下，上述產(chǎn)生的角蛋白半胱氨酸被氧化成角蛋白半胱氨酸磺酸鹽?？偡磻?yīng)如下：

Bailey &-Cole在出版物J-Biol。Chem.234，17133-1739，1959中也提供了同樣的反應(yīng)。正如上述專(zhuān)利所公開(kāi)，預(yù)處理按如下方式進(jìn)行：在3.5升水中用約27%NaHSO3和約24%Na2S4O6;PH＝9以及約40℃條件下處理經(jīng)切割過(guò)的100g羊毛（其濃度低于3%）。處理時(shí)間是15小時(shí)。處理后用足夠的水洗滌羊毛。

在溫和條件下實(shí)際水解反應(yīng)是在變性以及用蛋白酶沖洗后進(jìn)行的。

按照德國(guó)專(zhuān)利NO.2705669的公開(kāi)進(jìn)行的水解過(guò)程，方法如下。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的含有角蛋白的物質(zhì)即毛發(fā)或羊毛混合到95升水中的混合物中（濃度約7%）。溫度維持在50～55℃，pH維持在9.5。攪拌混合物。將一定量的尿素及硫酸銨加入到該混合物中。用氨水控制pH。水解時(shí)間為10到20小時(shí)。至于酶，可用芽孢桿菌蛋白酶。在完全水解后立即將混合物加熱到95℃以便破壞酶活性。過(guò)濾水解產(chǎn)物，將溶液干燥。水解產(chǎn)物的平均分子量是1000到3000。

將按照德國(guó)專(zhuān)利NO.3305305中公開(kāi)的水解過(guò)程進(jìn)行預(yù)處理的頭發(fā)在3升酶溶液中混合，（濃度3.4%）。用氨磺調(diào)節(jié)pH到9，將溫度維持于40℃。至于酶，可用商品蛋白酶。始終不停地?cái)嚢杌旌衔?。水解反?yīng)時(shí)間是3小時(shí)。在水解進(jìn)行完全后，過(guò)濾水解產(chǎn)物，并分離得到的成分。將濾液凍干（冷凍干燥）。水解產(chǎn)物中大部分肽的分子量在1100到7500范圍內(nèi)。

長(zhǎng)期以來(lái)人們把含有角蛋白的副產(chǎn)品如羽毛，頭發(fā)，鬃毛，馬鬃，觸須，分趾蹄以及蹄看作是幾乎沒(méi)有利用價(jià)值的或者是難于處理的廢物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)角蛋白的氨基酸成分是有用的，尤其是含硫的氨基酸可用于提高動(dòng)物飼料蛋白的營(yíng)養(yǎng)以及增加飼料的種類(lèi)。另一方面，角蛋白含有的氨基酸相同于人的皮膚和頭發(fā)中的氨基酸組成，因?yàn)樗鼈冎辽俨糠钟山堑鞍捉M成。因此，角蛋白水解產(chǎn)物是一種用于清洗頭發(fā)和皮膚的合適的和有利的化妝品成分。由此產(chǎn)生的一個(gè)問(wèn)題是怎樣將角蛋白水解為合適長(zhǎng)度水溶性的或部分水溶性的多聚或寡聚肽，在這些肽中原始氨基酸組成沒(méi)有變化，并且可以在動(dòng)物的消化道中消化，另一方面，這些肽適用于化妝品工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

在研究生產(chǎn)所需的水解產(chǎn)物這一論題以及我們的嘗試中，我們發(fā)現(xiàn)了在上面所提到的專(zhuān)利中存在某些沒(méi)有解決的問(wèn)題，在申請(qǐng)人已知的其它文件中也沒(méi)有解決這些問(wèn)題。令人驚奇的是，我們已發(fā)現(xiàn)可在排除有害的浪費(fèi)和散發(fā)的情況下較經(jīng)濟(jì)地解決這些嚴(yán)重的問(wèn)題，例如在預(yù)處理和水解階段的水溶液混合物中存在少量含有角蛋白的物質(zhì)，在水解后以及處理結(jié)束后的產(chǎn)品中的高鹽含量，在酸性條件下最后加熱后釋放出二氧化硫（SO2），以及從足夠濃度的水解中直接獲得的特定大小的多聚和寡聚肽。

因此本發(fā)明的主要特征如權(quán)利要求1的特征部分的內(nèi)容所闡述。因而我們明白如果溫度提高到60℃，可以在不產(chǎn)生不利的副作用的情況下加速亞硫酸鹽的水解。那么可使預(yù)處理時(shí)間從四小時(shí)以上縮短至低于1小時(shí)。

正如本發(fā)明所述，酶促角蛋白水解的部分，即：角蛋白的變性，也就是說(shuō)，打開(kāi)硫橋，是用化學(xué)方法進(jìn)行的。將含有角蛋白的物質(zhì)如羽毛和頭發(fā)在合適的切割機(jī)中切割成3至6mm時(shí)是最成功的。將經(jīng)過(guò)切割的材料在反應(yīng)器中盡可能地與水混合。優(yōu)選的是該混合物中經(jīng)切割物質(zhì)的干物質(zhì)含量占約5～15%。將亞硫酸鹽例如以Na2SO3的形式加入混合物中得到亞硫酸鹽水解物。亞硫酸鹽含量可在干物質(zhì)的5～25%范圍內(nèi)變化并且主要依賴(lài)于需要水解的程度，以及所用的處理溫度和時(shí)間而定。加入一種約為干物質(zhì)的0～20%的潛在的氧化物例如氯化銅，優(yōu)選的是硫代硫酸鹽，以進(jìn)行氧化亞硫酸鹽水解，改變由酶處理產(chǎn)生的水解程度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，混合物的pH調(diào)節(jié)在6-9范圍內(nèi)，較好的是6.5到8.0范圍。在制備飼料時(shí)用NaOH，較好的是用KOH和/或H2SO4調(diào)節(jié)pH。溫度調(diào)至60～100℃，處理時(shí)間從10分鐘到4小時(shí)，優(yōu)選的是10～60分鐘。百分?jǐn)?shù)以w/w計(jì)。

第二階級(jí)包括實(shí)際的酶處理即水解步驟。由于羽毛或頭發(fā)不需要清洗該步驟可在預(yù)處理使用的同一反應(yīng)器中完成。如果干物質(zhì)含量合適，可在預(yù)處理后直接開(kāi)始水解。連續(xù)攪拌該混合物。優(yōu)選的是將pH控制在6～8.5范圍。根據(jù)所用的酶將溫度按排在55～80℃。對(duì)于酶可利用一種蛋白酶或幾種蛋白酶的混和物，其最適pH值是中性或弱堿性，并且盡可能地具有抗熱性。合適的酶是由細(xì)菌（如：芽孢桿菌），霉菌（如曲霉）以及植物和動(dòng)物產(chǎn)生的由不同制造商提供的商品中性和堿性蛋白酶，或其他合適的蛋白水解酶。除了上面的要求外選擇一種酶或一種酶混合物還需考慮最后產(chǎn)品的肽鏈長(zhǎng)度。配制的酶的量主要依靠所需要的活性大小而定。活性量主要是由反應(yīng)物量所需水解時(shí)間而定。所需要的水解時(shí)間越短，反應(yīng)物濃度越大則所需活性量越大。

在預(yù)處理級(jí)段后，緊接著進(jìn)行水解得到的最后產(chǎn)品即水解產(chǎn)物中含有的干物質(zhì)的量很少以至于沒(méi)有許多用處，因而必須濃縮。達(dá)到這個(gè)目的的辦法是按照多次分批的原則在水解反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中直接加入經(jīng)過(guò)預(yù)處理和經(jīng)過(guò)過(guò)濾的羽毛。加入次數(shù)可以是1-3次。由于預(yù)處理后，羽毛和頭發(fā)的混合物容易攪拌，因而一次加入一批是可行的。后面追加的羽毛批量的處理較好的是在過(guò)濾前面批量的羽毛的濾液中進(jìn)行。因此，由于在處理時(shí)不是所有的反應(yīng)物都被耗盡，在下一步的處理中僅加入所要求的反應(yīng)物量中失去的部分即可，例如Na2SO3和Na2S4O6。這種方法是較為可取的，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)中最后產(chǎn)品中的鹽含量少，只占干物質(zhì)的3～8%，而一次性投料的水解產(chǎn)物中鹽占10～15%，并且在加熱處理最后產(chǎn)品時(shí)酸中產(chǎn)生的SO2量也很低。將其余批量的投料延后加入還可以提高水解過(guò)程中混合物的流動(dòng)性和可攪拌性。按照這種方法，可使最后產(chǎn)品中獲得15～25%的干物質(zhì)含量。

如果已知酶活性量以及其它因素，則根據(jù)所需要的水解程度即可確定水解時(shí)間。已證明最合適的水解時(shí)間是4至8小時(shí)。由于僅在批投料時(shí)加入全部“計(jì)算出”的酶的量，而在其他批量投料時(shí)只需加入前面量的一半，因而多次投料的水解法可以強(qiáng)化酶的使用。

水解后，根據(jù)從該混合物中減少的亞硫酸鹽的量的多少以及預(yù)期轉(zhuǎn)變?yōu)榻堑鞍装腚装彼幔ń堑鞍?S-）的角蛋白半胱氨酸磺酸鹽（角蛋白-S-SO-3）的量的多少，從水解速率確定水解液用H2SO4調(diào)節(jié)的pH為2～5pH。確定pH后，將混合物加熱到70-100℃，加熱15～45分鐘，以便釋放SO2。選的是，SO2的釋放在預(yù)處理反應(yīng)器中進(jìn)行，使SO2轉(zhuǎn)變成Na2SO3，它可用于下面的預(yù)處理步驟。

加熱用作動(dòng)物飼料的水解液，是將pH調(diào)節(jié)2.5～4.5并將它與飼料混合。從而使水解液溶于胃蛋白酶-鹽酸，測(cè)定溶解的/總蛋白的量為80～85%。在多次分批投料試驗(yàn)的水解液中鹽（Na2SO4）的含量是干物質(zhì)的3～8%，干物質(zhì)的含量為15～25%，而在一次性投料的水解液中鹽的含量是干物質(zhì)的10～15%，干物質(zhì)的含量5～10%。

如果用一定大小的寡聚肽制備角蛋白水解液，下面的方法很適合即將剛進(jìn)行水解或處理完的水解液的pH調(diào)至7到9加熱水解液至80-90℃一段時(shí)間，然后冷卻。在這段時(shí)間里，在低pH值時(shí)沉淀的蛋白質(zhì)又重新溶解。然后過(guò)濾掉固體部分。將濾液進(jìn)行微過(guò)濾，因此得到無(wú)菌的濾液。根據(jù)測(cè)定所需要的肽的大小，選擇超過(guò)濾膜片的分離度。如一個(gè)例子，用10，000分離度的濾膜將無(wú)菌濾液進(jìn)行超過(guò)濾。在該例子中，滲透液含有小于10，000道爾頓的肽。由此獲得的滲透液又可通過(guò)一個(gè)膜片進(jìn)行超濾。由此獲得角蛋白水解液，其中肽的大小是1，000到10，000，同時(shí)也將水解液濃縮到預(yù)期的濃度。濃縮過(guò)程的同時(shí)，也洗掉了低于1000道爾頓的肽以及其他化合物和鹽。在水解液處理結(jié)束后，在酸中加熱，半胱氨酸磺酸鹽寡聚肽轉(zhuǎn)變成單獨(dú)的半胱氨酸并釋放出SO2。在超過(guò)濾的同時(shí)，洗滌濃縮物，降低鹽含量。在堿性和氧化條件下肽的半胱氨酸之間重新形成硫橋。經(jīng)過(guò)超過(guò)濾使最后產(chǎn)品的濃度穩(wěn)定。通過(guò)冷凍干燥，噴霧干燥或真空干燥的方法將濃縮物干燥而得到干燥的最終產(chǎn)品。

水解方法

在一個(gè)2，000升反應(yīng)器中將215kg經(jīng)過(guò)切割的羽毛（干燥約為60kg）混合成均勻的735升混合物。將4.8kg Na2SO3加入到該混合物中，pH調(diào)至7.5。將混合物加熱到95℃在加熱的同時(shí)不停地?cái)嚢?，該過(guò)程持續(xù)40分鐘。

經(jīng)過(guò)上述處理后，將混合物冷卻至60℃，并將PH調(diào)至8.0，并用KOH保持該P(yáng)H值。至于水解過(guò)程中使用的酶，可用細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白水解酶（Maxatase，Gist-Brocades，Netherlands）。不停地?cái)嚢杌旌衔?，以便進(jìn)行充分混合。水解過(guò)程持續(xù)6小時(shí)。然后用H2SO4將PH調(diào)至4.0。同時(shí)，將約25升/分鐘的過(guò)濾空氣通入反應(yīng)器。按這種方法產(chǎn)生的SO2通入第二個(gè)反應(yīng)器，在該反應(yīng)器中以Na2SO3的形式溶于水中。經(jīng)過(guò)熱處理后，將水解液冷卻到60℃，裝入塑料容器中。

干物質(zhì)的水解液中粗蛋白占80.5%，灰分占14.5%，胃蛋白酶鹽酸的溶解度（可溶性/總蛋白）是82%。