背景及概述^[1][2]

系統(tǒng)名“1-甲基-4-酮-2-亞胺基咪唑啉”。分子式C4H7N3O。分子量113.12。由水中得葉片狀晶體或二水合正交棱晶體。溶于熱水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚、氯仿等。為尿、肌肉等的組成部分，在機(jī)體內(nèi)主要以磷酸肌酸的形式存在，游離肌酸酐很少。加熱至250℃變焦黃，295℃完全分解。紫外線下能發(fā)光。與次溴酸鈉溶液反應(yīng)24小時放出1mol氮。與濃磷酸于150℃加熱放出1mol氮，230℃時放出所有氮。

與過量苯甲醛或1mol亞芐基苯胺于150℃加熱得5-亞芐基肌酸酐，與3-硝基苯甲醛和香蘭素均有類似反應(yīng)。與氫氧化鋇水溶液和硝酸銀共熱氧化為甲基胍，與堿性高錳酸鉀或氧化汞反應(yīng)得甲基胍和草酸。與0.7%蘇打溶液反應(yīng)消除氨得到1-甲基乙內(nèi)酰脲，并能被苦味酸和苦味酸鉀定量分解。制法：由肌酸與90%乙酸或氯化鋅共沸，或由肌氨酸乙酯與胍在-15℃或與氰基氨于室溫下反應(yīng)而制得。用途：作生化研究試劑。

肌酸酐是磷酸肌酸代謝的產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是肌酸通過脫水縮合形成的內(nèi)酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通過血液循環(huán)到達(dá)腎臟并被過濾掉。對于腎功能正常的人群來說，血液 中的肌酸酐濃度因人因地而異。一般而言，在無大體力負(fù)擔(dān)的情況下，女性的血液中的肌酸 酐濃度在45-60μM；男性的血液肌酸酐濃度在60-110μM的范圍內(nèi)浮動。

檢測^[2]

肌酸酐的測量比較困難。目前常用的方法是質(zhì)譜法（同位素稀釋質(zhì)譜法）、高效液相色譜 法、液相色譜-質(zhì)譜連用法以及抗體檢測（ELISA），這些方法一般都需要昂貴的儀器，如質(zhì)譜儀、液相色譜儀或酶標(biāo)儀等，以及受過系統(tǒng)訓(xùn)練的分析化學(xué)操作人員的操作，極大地提高肌 酸酐測量的經(jīng)濟(jì)成本和時間成本，以及肌酸酐測量在邊遠(yuǎn)地區(qū)的應(yīng)用。

質(zhì)譜法通過在樣品中人為加入含有某種同位素（如O-18）的肌酸酐并對此樣品進(jìn)行質(zhì)譜 分析。比對質(zhì)譜結(jié)果中O-18的豐度和O-18在自然界中的豐度即可計(jì)算出肌酸酐的濃度。人 為加入的肌酸酐可以嚴(yán)格控制，作為一種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)（internalcalibration），這種方法可以有 效的降低誤差。

根據(jù)最新研究，用質(zhì)譜法得到的肌酸酐濃度偏低，這將在臨床上引起一系列問題，美國FDA也開始考慮新的肌酸酐檢測手段。液相色譜法是在質(zhì)譜的基礎(chǔ)上使用高效液相色譜對樣品進(jìn)行純化并用質(zhì)譜進(jìn)行檢測。質(zhì) 譜法和液相色譜法無法自動化、操作復(fù)雜，并且需要分析團(tuán)隊(duì)對儀器進(jìn)行操作和維護(hù)，而ELISA 法需要使用價(jià)格昂貴的酶標(biāo)儀，雖然其靈敏度極高，但是選擇性較差，經(jīng)常會高估肌酸酐的濃度，導(dǎo)致臨床用藥的過量或不足。

CN201310363461.0提供一種選擇性高、靈敏度高和使用方便 的肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種肌酸酐含量檢測試劑，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶， 熒光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成為肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸隨之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的過氧化氫。

在辣根氧化物酶的催化下，過氧化氫催化氧化了5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯并生成具有熒光響應(yīng)的產(chǎn)物，通過監(jiān)測熒光增強(qiáng)的速率以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得肌酸酐濃度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根過氧化物酶：熒光染料的重量比為：1：50：60：5。而且，包括如下三層結(jié)構(gòu)：

⑴染料底層：將熒光染料修飾過的纖維素和D4水凝膠混合并攪拌，在一張干凈的塑料 薄膜上用刮刀涂膜機(jī)涂上一層D4水凝膠的薄膜并使之自然風(fēng)干；

⑵蛋白酶固定層：在PVA-Sbq（聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯絡(luò)合物）的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反應(yīng)所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，攪拌25-40 分鐘以上，用刮刀涂膜機(jī)涂上一層酶的PVA-Sbq溶液，將紫外燈置于膜層的上方30分鐘，使苯基吡啶乙烯交聯(lián)并使膜層變干；

⑶頂層保護(hù)層：最后在上面用刮刀涂膜機(jī)涂上一層含有10%炭黑的D6水凝膠，并使膜 層自然風(fēng)干。

而且，三層結(jié)構(gòu)的具體制備步驟如下：

⑴將176mg纖維素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4 水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；

⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為100uM的薄膜并晾 干；

⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌 均勻；

⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μm，將薄膜置于紫外燈下30分鐘；

⑸在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風(fēng)干。

肌酸酐含量檢測試劑盒，包括上述的檢測試劑。制備方法步驟如下：

⑴將176mg纖維素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4 水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；

⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為100uM的薄膜并晾干；

⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、 340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌 均勻；

⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μm，將薄膜置于紫外燈下30分鐘；

⑸在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風(fēng)干。

試劑盒的使用方法，其特征在于：在含有100mMHEPES，150mM氯化鈉，5mM 氯化鉀，1.3mM氯化鈣的緩沖液中，pH7.3，加入不同濃度肌酸酐，用毛細(xì)管兩驅(qū)150μL 的樣品溶液并安插在試劑盒上并用熒光儀開始測量。

圖2為本發(fā)明肌酸酐傳感器使用的試劑盒的結(jié)構(gòu)；

主要參考資料

[1] 化合物詞典

[2] CN201310363461.0 一種三層結(jié)構(gòu)的肌酸酐含量檢測試劑的制備方法