T4-DNA連接酶一種封閉DNA鏈上切口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵。T4 DNA連接酶可催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合的反應(yīng)，需ATP作輔酶，不僅可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的DNA的連接，也可以催化DNA與RNA之間以及少數(shù)RNA之間的連接。

DNA連接酶（EC6。5。1。1）用于體外DNA連接、連接檢測PCR，體內(nèi)岡崎片斷連接成完整基因組DNA有重要作用。基因工程所用DNA連接酶由公司提供，最常用的是T4DNA連接酶（T4Lig）。因?yàn)閼?yīng)用廣泛并由公司提供，較多科研人員常忽略對其性質(zhì)的全面了解，導(dǎo)致體外平端DNA連接效率很低，轉(zhuǎn)化中出很多問題。