背景及概述^[1]

DNA連接酶（EC6。5。1。1）用于體外DNA連接、連接檢測PCR，體內(nèi)岡崎片斷連接成完整基因組DNA有重要作用?；蚬こ趟肈NA連接酶由公司提供，最常用的是T4DNA連接酶（T4Lig）。因?yàn)閼?yīng)用廣泛并由公司提供，較多科研人員常忽略對其性質(zhì)的全面了解，導(dǎo)致體外平端DNA連接效率很低，轉(zhuǎn)化中出很多問題。T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，在體外可在ATP輔助下，催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5′-P末端和3′-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。由于T4DNA連接酶的連接特性，連接酶是DNA復(fù)制過程中復(fù)制鏈的合成所必需的，并參與DNA損傷修復(fù)以及染色體重組等重要生命過程的調(diào)節(jié)，廣泛應(yīng)用于分子克隆中重組DNA的構(gòu)建等領(lǐng)域。然而目前此種工具酶嚴(yán)重依賴進(jìn)口，各生產(chǎn)廠家隨產(chǎn)品的說明書中規(guī)定的參數(shù)不統(tǒng)一，使得產(chǎn)品質(zhì)量狀況參差不齊，缺乏一個統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)。

連接酶分子大小^[1]

T4Lig由T4嗜菌體30基因合成，最早從T4嗜菌體感染的E。coli提取。后來發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制缺失型嗜菌體中連接酶產(chǎn)量更高，從而作為連接酶的主要來源，目前市場供應(yīng)連接酶通過基因工程方法生產(chǎn)。Murry測定T4Lig分子量為63000~68000Da，Armstrong進(jìn)一步確定為55，230Da，由487個氨基酸（Aa）殘基組成，基因長度1464bp（GenBank序列號為X00039）。按照分子量與分子大小比例關(guān)系估算，T4Lig大小約3。4nm，可跨越約1個DNA雙螺旋長度（即10bp）。連接酶占據(jù)連接端口下游（5’-P端部）7~10bp，占據(jù)端口上游（3’-OH端部）3~5bp。只有487Aa的酶分子同時具有連接活性，拓?fù)洚悩?gòu)活性表明其結(jié)構(gòu)、功能比較復(fù)雜。與之相比，E。coliDNA連接酶671Aa，分子量74000Da，每個E。coli細(xì)胞含有約300個DNA連接酶分子，與DNA聚合酶分子個數(shù)接近，可以滿足DNA復(fù)制時岡崎片斷連接需要，細(xì)菌和真核生物中岡崎片斷長度分別為1000bp左右和100~200bp。

連接酶保真性^[1]

相對于DNA聚合酶，連接酶保真性不太熟悉，特別是DNA體外連接的科研人員。連接酶保真性是指酶分子識別連接端口核苷酸的能力。T4Lig識別連接端口堿基能力較低，從而連接多種異常端口：3’或5’無嘌呤或無嘧啶堿基、缺失1nt的連接端口、3’和5’A-A或T-T配對、5’G-T配對、3’C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配對。連接反應(yīng)中加入亞精胺（spermidine）、高鹽緩沖液，或降低連接酶用量可以提高T4Lig保真性。Wu等發(fā)現(xiàn)100nMDNA在1UT4Lig，200mM高鹽濃度下保真性可提高60倍。隨著保真性提高，Km增加4倍，Vmax降低~30倍。釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）DNA連接酶保真性較高，可識別1nt缺失端口和3’A-G或T-G配對端口，但是識別5’A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高。5’-P端部核苷酸識別能力較低可能與5’-P-AMP復(fù)合物的形成有關(guān)。與常溫作用的T4Lig連接酶（37℃）不同，有些高溫作用的DNA連接酶：Pyrococcusfuriosu（sPfu）連接酶、Thermusaquaticus（Taq）連接酶、Thermusthermophilus（Tth）連接酶、Thermotogamaritima（Tma）連接酶。TaqDNA連接酶反應(yīng)溫度45~65℃，TmaDNA連接酶反應(yīng)溫度60℃。TaqDNA連接酶保真性比T4Lig、E。coliDNA連接酶高很多。TthDNA連接酶保真性比T4Lig高24倍。TthDNA連接酶具有3’-5’外切活性，可以切去與模板非匹配堿基。TthDNA連接酶的保真性較高，可能與TthDNA聚合酶3’-5’外切活性較低有關(guān)，高溫菌T。thermophilusDNA合成中很少摻入錯配堿基，需要TthDNA連接酶切去岡崎片斷連接時錯配堿基。TthDNA連接酶中K294R和K294P突變后，既保留了該酶的切口DNA連接活性，又提高了保真性約4倍和11倍。T4Lig識別錯配堿基能力較低，可能與T4DNA聚合酶的3’-5’外切活性有關(guān)。

連接機(jī)理與結(jié)構(gòu)^[1]

目前DNA連接反應(yīng)機(jī)理是基于切口雙鏈DNA底物得到的：普遍認(rèn)為連接反應(yīng)由三步完成：①T4Lig先由ATP供能產(chǎn)生E-AMP復(fù)合物；②E-AMP復(fù)合物識別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉(zhuǎn)移到5’-P基團(tuán)，形成5’-P-AMP復(fù)合物；③3’-OH親核攻擊5’-P-AMP形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。在PDB數(shù)據(jù)庫檢測不到T4Lig的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致連接機(jī)理不完全明了，特別是平端DNA連接機(jī)理不完善。以熱穩(wěn)定性PfuDNA連接酶晶體結(jié)構(gòu)為模板，筆者通過同源分子建模模擬T4Lig結(jié)構(gòu)。顯示出DNA連接酶有三個保守性結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DBD，腺苷酰化結(jié)構(gòu)域AdD（adenylaitiondomain，I130~E368），寡核苷酸鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域OBD（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。腺苷?；Y(jié)構(gòu)域AdD中K159是腺苷?；稽c(diǎn)，通過該位點(diǎn)形成N6-AMP-lysine酶-底物復(fù)合物。根據(jù)相似性比對發(fā)現(xiàn)，R164、R182、R359、K365是ATP結(jié)合位點(diǎn)，E217、E344二價金屬離子結(jié)合位點(diǎn)（UniProtKB登錄號：P00970）。

Rossi等切除T4LigN-端80個Aa、C-端57個Aa、C-端137個Aa分別得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突變體，酶學(xué)性質(zhì)表明N端80個Aa、C端57個Aa在DNA結(jié)合中起重要作用。模擬結(jié)構(gòu)顯示N端M1~L129是DBD結(jié)構(gòu)域，C端V369~E482是OBD結(jié)構(gòu)域，均與DNA結(jié)合有關(guān)。端部切除顯示E-DNA復(fù)合物有兩種狀態(tài)：腺苷酰化酶分子復(fù)合物的短暫態(tài)：是指ATP將AMP轉(zhuǎn)移到連接酶K159上形成E-AMP復(fù)合物；去腺苷?；瘧B(tài)酶分子復(fù)合物的穩(wěn)定態(tài)（S·complex）：是指E-AMP復(fù)合物將AMP轉(zhuǎn)移到連接端口5’-P基團(tuán)形成5’-P-AMP復(fù)合物，需要尋找附近的3-OH，所以此時E-DNA復(fù)合物是一種穩(wěn)定態(tài)，穩(wěn)定態(tài)復(fù)合物與平端連接有關(guān)。K159是T4Lig酶分子腺苷?；饔梦稽c(diǎn)，K159L突變體表明K159不參與識別DNA、但是K159L突變后酶分子不能完成自身腺苷?；?。在AMP存在下，K159L突變體具有DNA內(nèi)切活性，可以將超螺旋質(zhì)粒DNA切成環(huán)狀切口DNA，解除DNA超螺旋。

活力測定^[3]

（1）酶活力測定。按表2配置連接反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中以ddH2O代替待測酶設(shè)置空白對照，以加入能完全連接的酶量（15U/50μL）設(shè)置為陽性對照，電泳檢測點(diǎn)入λDNA-HindIIIMarker作為分子量對照。

輕輕混勻，16℃反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后65℃溫浴10min，置于冰上。電泳觀察連接情況，按連接情況加入酶的最小體積乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算酶活力。

（2）靈敏度。分別向連接體系中添加不同模板量，對該方法的模板靈敏度進(jìn)行考察，按表3配制連接反應(yīng)體系。

輕輕混勻，16℃反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后65℃溫浴10min，置于冰上。電泳觀察連接情況，判斷能檢測到的連接最低模板量。

（3）重復(fù)性。按照表3（λDNA-HindIII加入量為1μg）配制連接體系，配制6個平行反應(yīng)，16℃反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后65℃溫浴10min，置于冰上，電泳觀察連接情況。

（4）穩(wěn)定性。根據(jù)表3（λDNA-HindIII加入量為1μg）配制連接體系，配制2個平行反應(yīng)，16℃分別反應(yīng)30min，1，2，4h，連接過夜，電泳觀察連接情況。

主要參考資料

[1] 衛(wèi)生學(xué)大辭典

[2] T4 DNA 連接酶性質(zhì)及其平端連接功能

[3] T4DNA連接酶性質(zhì)及其平端連接功能