背景[1-6]
SuperBlock(PBS)Blocking Buffer是一種含有單一純化的糖蛋白的阻斷試劑，可為ELISA，IHC和蛋白質(zhì)印跡分析提供極其快速有效的阻斷。
SuperBlock阻斷緩沖液的特點：
1快速-在5到10分鐘內(nèi)阻斷膜，在2分鐘內(nèi)阻斷ELISA板
2靈活-保證不含生物素，與鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)一起
3低背景-非血清蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生高信噪比
4穩(wěn)定-儲存緩沖液在4°C下保存一年;儲存塊板干燥長達12個月
使用SuperBlock緩沖液阻擋微板，膜或組織可在大多數(shù)檢測系統(tǒng)中產(chǎn)生高信噪比?；诘鞍踪|(zhì)的配方不含任何免疫球蛋白，白蛋白或內(nèi)源性生物素，使其在許多傳統(tǒng)阻斷劑失效的情況下兼容。緩沖劑在封閉涂覆的聚苯乙烯微孔板（96孔板）和穩(wěn)定它們以便干燥和儲存以備后用時特別有效。SuperBlock(PBS)阻斷緩沖液優(yōu)于牛奶，可靈敏檢測目標蛋白。
通過SDS-PAGE分離HeLa細胞裂解物（20,10,5,2.5,1.25,0.625和0.3125μg），并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或PVDF膜。使用含有0.05％Tween*-20洗滌劑的Tris緩沖鹽水或含有0.05％Tween-20洗滌劑的磷酸鹽緩沖鹽水中的SuperBlock封閉緩沖液，將膜封閉1小時。探測膜的指示目標。將印跡在Thermo Scientific SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物中溫育5分鐘并暴露于膜上。
應(yīng)用[7][8]
用于ELISA，免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡封閉阻斷。
卵巢癌是世界范圍內(nèi)最致命的婦科惡性疾病之一,由于缺乏典型的臨床癥狀、特異的體征及腫瘤標志物等有效的篩查手段,絕大多數(shù)卵巢癌病人在得到診斷時已處于晚期,使其死亡率高居婦科惡性腫瘤首位。腫瘤的轉(zhuǎn)移能力有賴于細胞的遷移與侵襲,然而決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的分子機制目前仍然不十分清楚。因此,努力探索調(diào)控卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的分子靶標將至關(guān)重要。Hedgehog(Hh)信號通路在細胞命運決定以及細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。
該通路由Hh配體,膜受體Ptch和跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smo以及參與Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞漿蛋白復(fù)合體組成,其級聯(lián)傳導(dǎo)的末點被公認為鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli(Glioma-associated oncogene transcription factors),是該信號通路的關(guān)鍵節(jié)點,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起樞紐作用。Hh靶基因涉及細胞增殖、細胞存活、細胞分化、細胞周期以及干細胞形成和細胞侵襲等多方面。
有研究發(fā)現(xiàn)：卵巢癌中Hedgehog(Hh)信號通路異常活化,但信號通路異?；罨c卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系有待進一步明晰。方法：部分人上皮性卵巢癌組織中Hedgehog信號通路異?；罨c臨床病理特征的關(guān)系(1)為了證實在卵巢癌中存在Hh信號通路的異?；罨?我們采用免疫組化技術(shù)檢測了65例卵巢癌病人卵巢腫瘤組織石蠟切片中Hh信號通路重要組分蛋白Gli2的表達情況,并且在此基礎(chǔ)上將Gli2的表達情況與卵巢癌的臨床病理特征進行了相關(guān)性分析。(2)同時,通過Western-blot及real-time PCR等方法檢測卵巢癌及正常卵巢組織中Hh信號通路重要組分蛋白Shh、Gli1、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平的表達情況。
第二部分抑制Hedgehog信號通路降低卵巢癌細胞增殖與遷移能力(1)為了探索Hh信號通路與卵巢癌細胞增殖與遷移能力的關(guān)系,我們以卵巢癌細胞系(SKO-V3和ES-2)為研究對象,采用轉(zhuǎn)錄因子Gli特異性小分子抑制劑GANT61處理SKO-V3和ES-2細胞,對加藥處理(實驗組加30μM GANT61,對照組加等體積的DMSO)的SKO-V3和ES-2細胞通過Western-blot、real-time PCR及免疫細胞化學(xué)方法在蛋白水平以及mRNA水平檢測了Hh信號通路中相關(guān)組分,如跨膜受體Smo,終末轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2的表達情況。
采用real-time PCR和Western blot分別對芯片發(fā)現(xiàn)的富集于某些信號通路的差異基因以及相關(guān)基因(如ITGB4、FAK、CD24、MMP7等)在mRNA水平和蛋白水平進行驗證,以確認芯片結(jié)果的可靠性。Western blot結(jié)果顯示：實驗組裸鼠皮下移植瘤中Gli1和Gli2蛋白表達水平明顯低于對照組裸鼠,相對定量結(jié)果提示差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義,(p<0.01)；免疫組織化學(xué)法檢測實驗組裸鼠及對照組裸鼠皮下移植瘤中ITGB4及p-FAK的蛋白表達水平,結(jié)果顯示實驗組相比對照組瘤體中ITGB4及p-FAK的蛋白表達水平明顯下降。
參考文獻
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