背景^[1-6]

石蠟包埋DNA樣本修復(fù)試劑是針對FFPE樣本而設(shè)計的修復(fù)試劑，可修復(fù)低質(zhì)量FFPE樣本不同程度的損傷，提高文庫產(chǎn)量及測序質(zhì)量。石蠟包埋DNA樣本修復(fù)試劑可修復(fù)5 ng-1μg Fragmented FFPE DNA。世界上絕大多數(shù)的組織樣品是使用福爾馬林固定或石蠟包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，F(xiàn)FPE)的方法處理的。要想提取出其中的核酸信息，相當有難度，因為FFPE樣品中的DNA和RNA已經(jīng)部分降解了，且DNA往往與組蛋白緊密交聯(lián)。從福爾馬林貨石蠟包埋組織中提取核酸，是病理、法醫(yī)等學(xué)科從分子水平上進行研究的基礎(chǔ)。

根據(jù)不同的石蠟包埋方式，有兩種提取方法：FFPE DNA Kit/石蠟包埋組織DNA提取試劑盒與GBCquick FFPE DNA Kit/石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒，現(xiàn)就各自的特點介紹如下：

FFPE DNA Kit/石蠟包埋組織DNA提取試劑盒采用傳統(tǒng)的二甲苯的脫蠟方式來操作的，預(yù)先脫蠟后按組織DNA提取方法進行后續(xù)操作，主要包括SDS/蛋白酶K的消化蛋白，之后再加入胍鹽與無水乙醇后過柱特定吸附核酸，經(jīng)簡單的洗滌之后，洗脫出高質(zhì)量的DNA。該方法的優(yōu)點是經(jīng)典可靠，為許多公司的試劑盒采用，；本方法的缺點是要接觸有毒的二甲苯，而且在二甲苯預(yù)處理的過程中可能會把一些潛在的病毒、細菌等除去，如果要獲得病原菌的核酸信息可能不是最理想的純化方式。

GBCquick FFPE DNA Kit采用的獨特的脫蠟劑，操作過程中無需預(yù)先脫蠟，把脫蠟與組織的消化裂解結(jié)合在一起，這樣既簡化了操作的步驟，也能把潛在的病毒、細菌等病原微生物的核酸完全純化下來。而且，采用的獨特脫蠟劑是無毒無臭的，作為最新的操作方式而逐漸為廣大用戶采用。

不論是FFPE DNA Kit還是GBCquick FFPE DNA Kit操作的重點在于在過柱吸附之前組織必須要完全溶解，如果組織還沒有完全溶解的話，就要繼續(xù)消化。最后結(jié)果應(yīng)該是表面光滑的半透明溶液，看不到任何微粒。孵育時間也取決于組織。例如，低密度組織(肺)所需的孵育時間就比高密度組織(心臟)少。有些樣品、甚至連續(xù)消化3-5天才能獲得比較高的產(chǎn)量。

在臨床和分子生物學(xué)研究中，新鮮組織樣本往往難以獲得，甲醛固定石蠟包埋組織(FFPET)是目前最常用的人類病歷檔案標本。石蠟包埋組織被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、法醫(yī)鑒定、科學(xué)研究等方面。但是，在福爾馬林固定和石蠟包埋時，由于受到多種因素和條件的影響，不可避免的造成DNA降解和交聯(lián)，為從FFPET中提取高質(zhì)量基因組DNA帶來了困難。

應(yīng)用^[7][8]

石蠟包埋DNA樣本修復(fù)試劑可用于石蠟包埋DNA的樣本修復(fù)：

福爾馬林固定、石蠟包埋組織中提取DNA的方法。

方法：①根據(jù)石蠟切片厚度(2.5μm、5.0μm、10.0μm)、組織切片脫蠟時間(切片脫蠟2次,時間分別為2小時、2小時和2小時、12小時)、消化液中蛋白酶K濃度(125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml)、組織消化時間(4小時、8小時、12小時、24小時)等參數(shù)的不同,排列組合出96種不同條件,分別用于提取DNA。②石蠟組織連續(xù)切片,切片在二甲苯恒溫水浴中振蕩脫蠟后無水乙醇漂洗,真空干燥,加入細胞裂解液(自制),恒溫水浴中振蕩消化組織,苯酚/氯仿/異戊醇反復(fù)抽提,醋酸鈉沉淀DNA,離心去上清,保存DNA備用。③不同方法提取的DNA量的檢驗:稀釋200倍的DNA溶液用分光光度計在260nm和280nm分別讀出光密度值,即OD260值和OD280值,DNA含量為:OD260值×10(μg/μl)。④不同方法提取的DNA質(zhì)的檢驗:所有標本的OD260/OD280值均應(yīng)該在1.6-1.8范圍內(nèi),說明DNA中無蛋白、RNA和苯酚污染。

PCR反應(yīng)擴增所提取的DNA中RET基因第11外顯子,10μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳,初步判斷提取的DNA是否可以用于PCR反應(yīng);從瓊脂糖凝膠中純化目的基因DNA后再次以分光光度計測量純化后的DNA含量,比較提取的DNA經(jīng)PCR擴增后目的基因的產(chǎn)量;純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光標記后自動測序儀測定目的基因堿基序列,觀察提取的DNA是否可以用于直接序列測定。

結(jié)果所有標本提取的DNA之OD260/OD280值均在1.6-1.8范圍內(nèi)。各種石蠟切片厚度均可以提取一定數(shù)量的DNA,三組石蠟切片厚度之間比較無明顯差異。但2.5μm組提取的DNA用于PCR擴增時效果遠不如其它2組,即使PCR擴增后PCR產(chǎn)物電泳雖可見目的基因條帶,條帶也較淡,目的基因測序圖混亂,難以讀出堿基序列;2次脫蠟時間為2、2小時組脫蠟效果不如2次脫蠟時間為2、12小時組。

;隨著蛋白酶K濃度的增加,提取的DNA數(shù)量也增加,最后行DNA測序時蛋白酶K濃度為500μg/ml和1000μg/ml組均可以得到滿意的DNA測序圖;組織消化8小時、12小時和24小時得到的DNA均適用于序列測定,但8小時組提取的DNA經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)物較12小時和24小時組少,12小時組與24小時組間比較無明顯差別。目的基因DNA含量大于16ng/μl的標本測序時測序圖較好,否則不適合于測序。

參考文獻

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