背景及概述[1]
核糖核酸酶A是一類水解RNA的酶，廣泛存在于所有動植物和微生物中，按其作用位點和磷酸酯鍵斷裂的方式可分為生成3′-磷酸基團的內(nèi)切核糖核酸酶(膜核糖核酸酶、核糖核酸酶T1和生成5′-磷酸基團的內(nèi)切核酸酶(RNase H)、外切核糖核酸酶(大腸桿菌RNaseⅡ、大腸桿菌的寡核苷酸RNase、RNA的腫瘤病毒的RNase H)。核糖核酸酶，核糖核酸酶T1是實驗室中除去樣品中的RNA或RNA順序測定中常用的酶。胰核糖核酸酶(RNase A)是從牛胰中提取的RNase，是高度專一的內(nèi)切核酸酶，專一水解RNA鏈中的嘧啶核苷酸鍵，生成3′-嘧啶核苷酸或3′末端為嘧啶核苷酸的寡核苷酸，核糖核酸酶T1是從米曲霉菌中制備的一種高度專一性的內(nèi)切核酸酶，專一水解RNA產(chǎn)生3′鳥苷酸和3′端為鳥苷酸的寡核酸。核糖核酸酶H(RNase H)常用于反轉(zhuǎn)錄合成中，只作用于DNA-RNA雙鏈中的RNA。
提取方法[2]
一種核糖核酸酶A的提取方法，分離提純具有酶活性的、高純度的S核糖核酸酶，可用于分離提純其它薔薇科果樹(如蘋果、杏、梅、櫻桃等)雌 蕊S基因的S核糖核酸酶和其它植物組織特異性蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的一種核糖核酸酶提取方法，包含下列步驟：
1)植物樣品的采集：采集開花前的大花蕾，從花蕾分解出花柱，經(jīng)稱重后裝入塑 料瓶內(nèi)，保存于液氮中待用；
2)抽提液的制備(配方)：以MES/NaOH緩沖液(pH＝6.5)為制備抽提液的溶液， 按溶液體積比添加3％的polyclar-AT、1.5％抗壞血酸鈉和5mmol·L-1的EDTA·Na2， 得到核糖核酸酶抽提液A；
3)抽提過程：
在1～4℃低溫條件下，取花柱樣品，加入上述核糖核酸酶抽提液A進行提取后，離心，上清液為花柱可溶性蛋白質(zhì)溶液，經(jīng)過孔經(jīng)0.45μm的過濾網(wǎng)過濾后，以流速 0.5～1ml/min的速率通過CM瓊脂糖凝膠(CM sepharose)陽離子交換層析柱之后，用 100～200ml的20mmol·L-1 MES/NaOH緩沖液清洗上述CM層析柱，而后用100～200ml 的350mmol·L-1NaCl溶液將核糖核酸酶從CM層析柱中洗脫下來，獲得核糖核酸酶 溶液B；
按體積比添加4倍液的20mmol·L-1MES/NaOH緩沖液稀釋，同樣經(jīng)孔徑0.45μm 的過濾網(wǎng)過濾后，將其以流速0.5～1ml/min的速率通過SP瓊脂糖凝膠(SP sepharose) 陽離子交換層析柱；用100～200ml的180mmol·L-1NaCl溶液以相同的流速來清洗上述SP層析柱；再用100～200ml的250～320mmol·L-1的NaCl溶液將吸附于SP層析柱內(nèi)的核糖核酸酶全部溶出，回收得到核糖核酸酶溶液C；
核糖核酸酶溶液C用按溶液體積計算100％飽和的硫酸銨沉析后離心，獲得核糖 核酸酶。
相關研究[3-4]
王立霞等人為了了解核糖核酸酶ARnaseⅢrncS基因缺失對單核細胞增生李斯特菌(LM)環(huán)境應激和生物被膜形成的影響，以LMSB5強毒株為對象，利用溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7，通過基因重疊延伸PCR(SOE-PCR)和同源重組技術構(gòu)建LM-ΔrncS基因缺失突變株，檢測其在不同溫度、pH、高鹽、乙醇、H2O2脅迫環(huán)境下的適應能力，通過結(jié)晶紫染色法檢測生物被膜的形成能力。
結(jié)果：與LM-SB5株相比，構(gòu)建的LM-ΔrncS在37℃、pH 4及pH 7的環(huán)境適應能力無顯著變化(P>0.05)，而在30℃、42℃、pH 9、5%NaCl、3.8%乙醇、0.1%H2O2的應激環(huán)境下其適應能力及生物被膜的形成能力顯著降低(P<0.05)，提示RnaseⅢRncS參與了LM對低溫、高溫、堿、高鹽、乙醇及H2O2脅迫環(huán)境的適應過程及生物被膜形成的調(diào)控。結(jié)論：構(gòu)建的LM-ΔrncS基因缺失突變株，在不同應激環(huán)境下的適應能力及生物被膜形成能力均顯著降低，為RnaseⅢRncS參與LM ncRNA調(diào)控環(huán)境應激的分子機制研究奠定了基礎。
楊科成等人利用分子動力學模擬研究了在不同尿素濃度下，核糖核酸酶Sa(RNase Sa)表面水和尿素分子的分布和動力學行為。結(jié)果表明，尿素分子可與RNase Sa酶形成較強的相互作用，并取代其表面的水分子而富集在蛋白質(zhì)表面。尿素分子更傾向與RNase Sa酶的疏水殘基作用，與RNase Sa酶主鏈形成氫鍵的能力更強。尿素分子的平動和轉(zhuǎn)動遠遠慢于水分子的平動和轉(zhuǎn)動。RNase Sa酶表面水分子的平動和轉(zhuǎn)動隨著尿素濃度增加而逐漸變慢，但RNase Sa酶表面尿素分子的動力學并不依賴于尿素濃度變化。本研究中明晰的RNase Sa酶表面水和尿素分子分布和動力學有助于理解水和尿素分子對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。
主要參考資料
[1] 衛(wèi)生學大辭典
[2] CN02137955.6 一種核糖核酸酶A的提取方法
[3] 王立霞，孟慶玲，喬軍，蔡擴軍，王登峰，伍曄暉，王熙鳳，郭晶，才學鵬.核糖核酸酶ARnaseⅢ rncS基因缺失對單核細胞增生李斯特菌環(huán)境應激的調(diào)控作用研究[J].中國病原生物學雜志，2018，13(10):1078-1083.
[4]楊科成，崔鳳超，李云琦.核糖核酸酶Sa表面水和尿素分子的分布和動力學行為的分子動力學模擬[J].應用化學，2018，35(10):1243-1248.