背景技術(shù)
核糖核酸酶A(RNaseA)是內(nèi)切核糖核酸酶，可特異地攻擊RNA上嘧啶殘基的3'端，切割與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵。核糖核酸酶A是脊椎動(dòng)物所特有的蛋白質(zhì)家族，除了水解RNA以外，它們還參與細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡、血管生成以及宿主防御等過程，在疾病的診斷和治療方面表現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。
RNaseA家族成員具有很高的序列相似性，它們大多含有6-8個(gè)半胱氨酸并形成分子內(nèi)二硫鍵，以維持特有的空間結(jié)構(gòu)。RNaseA基因結(jié)構(gòu)中不含有內(nèi)含子，成熟的RNaseA的氨基酸序列中均含有非常保守的CKXXNTF氨基酸序列(XX為任意氨基酸）。
核糖核酸酶A最早是在牛的胰腺中發(fā)現(xiàn)的，牛胰腺核糖核酸酶A包括一個(gè)374bp的開放閱讀框，編碼124個(gè)氨基酸的多肽鏈(如SEQIDN0:4所示），預(yù)測其等電點(diǎn)為8.30,分子量為14kD。
牛胰腺核糖核酸酶A是個(gè)被應(yīng)用于動(dòng)物腫瘤和白血病臨床治療的RNaseA，并取得一定的效果。目前所用的RNaseA多從牛胰腺中提取，雖然原料來源豐富，但純化的技術(shù)要求較高，而且有DNA酶和病毒(如牛海綿狀腦病病毒)污染危險(xiǎn)，因此，WHO和FDA等國際權(quán)威機(jī)構(gòu)明確規(guī)定動(dòng)物源性的牛核糖核酸酶A不能用于制備人和動(dòng)物基因治療或基因免疫用途的重組質(zhì)粒。
張泉等發(fā)表的論文"牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表達(dá)及初步鑒定"中提出利用RT-PCR從牛胰腺總RNA中擴(kuò)增出大小和序列正確的RNaseAcDNA，并在大腸桿菌中獲得分泌性表達(dá)重組酶，為生物制品級核算疫苗或基因治療用途質(zhì)粒DNA的制備提供了借鑒。但是，使用該方法誘導(dǎo)表達(dá)的重組核糖核酸酶A蛋白表達(dá)量不高，且純化困難。
純化生產(chǎn)工藝
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
含有新型核糖核酸酶A基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
對SEQIDN0:2所示的基因序列進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。該基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，我們將其稱之為新型核糖核酸酶A。新型核糖核酸酶A與現(xiàn)有的牛胰腺核糖核酸酶A氨基酸序列（SEQIDN0:4所示，其堿基序列如SEQIDN0:3所示）相比，其突變位點(diǎn)為第38位、第88位、第109位、第120位，分別由D突變?yōu)镽、由G突變?yōu)镈、由A突變?yōu)镽、由F突變?yōu)镚。新型核糖核酸酶A由124個(gè)氨基酸殘疾組成，屬堿性蛋白質(zhì)，其具有核糖核酸酶A家族的典型結(jié)構(gòu)，如由8個(gè)半胱氨酸形成的四個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和CKXXNTF特征結(jié)構(gòu)，屬于核糖核酸酶A家族。
含有新型核糖核酸酶A基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建，包括以下步驟：
S1:對SEQIDN0:2所示的基因序列進(jìn)行全基因合成（由華大基因合成），得到新型核糖核酸酶A基因。
S2:將新型核糖核酸酶A基因連接到PPIC9K載體(購自invitrogen)上，構(gòu)建PPIC9K重組質(zhì)粒。
S3:將重組質(zhì)粒從大腸桿菌中提取出來，將PPIC9K重組質(zhì)粒線性化，然后電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115(購自invitrogen)中。
質(zhì)粒DNA線性化(5X0.5mLEP管中酶切體系）：
混合，稍離心，37°C，酶切150min左右，電泳檢測質(zhì)粒酶切程度，以未酶切質(zhì)粒作為參照，線性化后質(zhì)粒位于未酶切質(zhì)粒上方。
酵母電轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞制備：
1)在含5mlYPD的50ml離心管中，培養(yǎng)畢赤酵母，30度過夜，取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種含l〇〇ml新鮮培養(yǎng)基的500mL搖瓶，過夜生長至0D600=1.3-1.5(早7點(diǎn)挑單菌落至5mlYro培養(yǎng)基中，260rpm搖菌，晚10點(diǎn)轉(zhuǎn)接至500ml搖瓶中，250rpm搖菌，次日下午可做感受態(tài))；
2)在4度，1500g離心5min收集細(xì)胞，用100ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；
3)如上離心，用50ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；
4)如上離心，用4ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞至4X1.5mL離心管中；
5)如上離心，用200ul預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約400ul。
轉(zhuǎn)化:采用電轉(zhuǎn)杯，去離子水洗凈，紫外燈照射過夜：
1)取80ul上述細(xì)胞與5-20ug線性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中；
2)在冰上放置5min;
3)根據(jù)所使用裝置推薦的釀酒酵母參數(shù)進(jìn)行電擊，參數(shù)：1500￥、400〇、251^、5msec；
4)立即加入1ml預(yù)冷的1M山梨醇至杯中，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中；
5)分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上；
6)在30度孵育平板至克隆產(chǎn)生，按P41篩選Mut+/Muts表型。
S4:篩選重組子，獲得畢赤酵母重組質(zhì)粒。
篩選:分別配制四個(gè)G418濃度梯度（1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL)的YH)篩選平板(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，1.5%瓊脂）。進(jìn)行培養(yǎng)的MD平板，用無菌牙簽各挑取70個(gè)酵母單菌落，點(diǎn)在上述四個(gè)G418濃度梯度的YPD篩選平板中，并作相應(yīng)編號。每個(gè)克隆均做4個(gè)梯度的篩選。