在生命科學(xué)研究中，RNA的提取和分析是常見且至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。然而，RNA極易被核糖核酸酶 A降解，核糖核酸酶 A（RNase）廣泛存在且穩(wěn)定，可耐受多種處理（如煮沸、高壓滅菌等）而不被滅活。它催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子，因而RNA制劑中只要存在少量的核糖核酸酶 A就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解，進(jìn)而直接影響RNA分析結(jié)果。因此，預(yù)防核糖核酸酶 A污染成為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

污染來源

1、實(shí)驗(yàn)人員體液、毛發(fā)

實(shí)驗(yàn)人員的體液中含有豐富的核糖核酸酶 A活性。所以不戴手套會(huì)非常容易造成RNase污染，對(duì)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)造成影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)需要穿著實(shí)驗(yàn)服，避免衣物上的某些顆粒物質(zhì)掉入樣品。避免在有氣流干擾的實(shí)驗(yàn)環(huán)境操作。

2、實(shí)驗(yàn)耗材（離心管、槍頭等）

實(shí)驗(yàn)室中槍頭和離心管很容易成為被忽視的RNase污染源頭。提取RNA時(shí)請(qǐng)確保使用經(jīng)過無RNase檢測(cè)并具有相關(guān)認(rèn)證的槍頭和離心管。高壓滅菌過的槍頭和離心管無法使RNase全部活性。

3、水源

實(shí)驗(yàn)過程中的水和緩沖液也是核糖核酸酶 A污染的常見來源。焦碳酸二乙酯（DEPC）處理是消除水體、緩沖液及其他溶液中RNase污染最為常用的方法。它是一種強(qiáng)烈的RNase抑制劑，其通過和RNase的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使RNase變性，從而抑制RNase的活性。

4、內(nèi)源性RNase

所有的組織樣品都含有內(nèi)源性的RNase。內(nèi)源性RNase含量高的組織：腎臟、腸、脾臟、胸腺、胰腺、貝/蝦類的肝胰腺等。組織取樣后若不直接提取，則需要用液氮迅速冷凍低溫保存，防止樣品降解。

預(yù)防污染

預(yù)防核糖核酸酶 A污染的策略主要包括以下幾個(gè)方面：

1、實(shí)驗(yàn)器具消毒：在RNA提取前，應(yīng)該徹底清洗和消毒所有使用的實(shí)驗(yàn)器具，包括離心管、移液器、試劑瓶等。

2、空間消毒：RNA提取應(yīng)在干凈的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行，避免灰塵和其他微生物的污染。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該定期進(jìn)行徹底的消毒和清潔。

3、操作人員防護(hù)：操作人員應(yīng)該全副武裝，戴手套以避免源自人手的RNA酶污染。

4、使用RNA酶抑制劑：在細(xì)胞裂解液中加入RNA酶抑制劑，使破碎細(xì)胞與滅活RNA酶同步進(jìn)行，最大限度地降低細(xì)胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。

5、樣本保存：組織取樣后若不直接提取RNA，要及時(shí)用液氮冷凍存于-80°C環(huán)境，并盡早進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣可使RNA的降解達(dá)到最少。

6、設(shè)立RNase-free區(qū)域：選擇遠(yuǎn)離/遮蔽通風(fēng)孔或開放窗口、走動(dòng)較少的區(qū)域作為RNase-free區(qū)域，以減少空氣中的核糖核酸酶 A污染。

7、培訓(xùn)人員并建立標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：制定詳細(xì)的RNA實(shí)驗(yàn)操作流程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以確保實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性和準(zhǔn)確性。

8、最后針對(duì)環(huán)境清潔：保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的清潔和衛(wèi)生，定期進(jìn)行清潔和消毒，以減少細(xì)菌和微生物滋生。

以上策略有助于預(yù)防核糖核酸酶 A污染，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。