背景^[1-3]

鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)是一種可以特異性結(jié)合鈣調(diào)節(jié)蛋白-1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的鈣調(diào)節(jié)蛋白-1蛋白。鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

鈣調(diào)節(jié)蛋白1是分子量為34kDa的蛋白，主要存在于平滑肌組織。它是一種高親和力肌動蛋白結(jié)合蛋白，但是也與原肌球蛋和鈣調(diào)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)肌肉收縮。結(jié)合F-肌動蛋白時，它抑制肌動蛋白激活的肌球蛋白ATP酶的活性。鈣調(diào)節(jié)蛋白1受到涉及PKC、CAMKII激酶和2A型磷酸酶的可逆磷酸化（reversible phosphorylation）調(diào)節(jié)。在非肌肉細(xì)胞中，鈣調(diào)節(jié)蛋白1可能在細(xì)胞遷移、運動和增殖中起一定作用。

鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)

鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體))。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)可以用于參芪健心方對慢性心力衰竭模型大鼠心功能及鈣調(diào)節(jié)蛋白水平的影響

通過觀察參芪健心方對慢性心力衰竭大鼠心功能及鈣調(diào)節(jié)蛋白的影響,以進(jìn)一步明確參芪健心方治療慢性心衰的有效性及可能的機(jī)制。研究方法:實驗選用SPF級雄性SD大鼠80只,體重在200±20g,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)和造模組(n=70),造模組采用左冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立心梗后慢性心衰大鼠模型,其中,假手術(shù)組采用相同手術(shù)方法但只穿線不結(jié)扎。術(shù)后4周,將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、貝那普利組、參芪健心方高劑量組、中劑量組、低劑量組。貝那普利組混懸液1.2g/kg/d灌胃;中藥高劑量組14.8g/kg/d、中劑量7.4g/kg/d、中藥低劑量組3.7g/kg/d灌胃,模型組及假手術(shù)組予以3ml/d的生理鹽水灌胃,藥物干預(yù)共計4周。藥物連續(xù)干預(yù)4周后,應(yīng)用多普勒超聲心動圖對所有大鼠進(jìn)行心功能檢測,記錄大鼠左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末容積(LVESV)、左室舒張末容積(LVEDV)。處死大鼠,采用腹主動脈取血法收集血液標(biāo)本,并使用鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測大鼠血清中的AngⅡ、BNP、ALD、ET-1含量。大鼠死亡后立即剪掉臟組織,并去除非組織部分,迅速將心臟沖洗干凈,濾紙吸干水分后分別稱重,記錄大鼠心臟重量(HW),計算心重指數(shù)=全心重量/體重(HW/BW,heart weight/body weight)。將心臟組織分為兩部分,其中一部分放置于4%多聚甲醛溶液中固定并使用4℃冰箱中保存,用來做HE染色和Masson染色,進(jìn)行心肌細(xì)胞病理學(xué)檢測及觀察心肌纖維化的發(fā)生;另一部分放入-80℃冰箱中保存,以備Western Blot檢測和Rt-q PCR分別檢測心肌組織中SERCA2a、Ca MKⅡ、Ry R2、NCX含量及m RNA含量。

鈣調(diào)節(jié)蛋白-1(抗體)研究結(jié)果血清BNP、AngⅡ、ALD、ET-1含量:與假手術(shù)組對比,模型組大鼠血清中BNP、AngⅡ、ALD、ET-1含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,參芪健心方各劑量組、貝那普利組大鼠血清中BNP、AngⅡ、ALD、ET-1含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

[1]Early calcium handling imbalance in pressure overload-induced heart failure with nearly normal left ventricular ejection fraction[J].Sarah Rouhana;;Charlotte Farah;;Jerome Roy;;Amanda Finan;;Glaucy Rodrigues de Araujo;;Patrice Bideaux;;Valérie Scheuermann;;Youakim Saliba;;Cyril Reboul;;Olivier Cazorla;;Franck Aimond;;Sylvain Richard;;Jér?me Thireau;;Nassim Fares.BBA-Molecular Basis of Disease.2018

[2]3,7-Bis(2-hydroxyethyl)icaritin,a potent inhibitor of phosphodiesterase-5,prevents monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension via NO/cGMP activation in rats[J].Tao-Hua Lan;;Xiao-Ling Chen;;Yun-Shan Wu;;Hui-Liang Qiu;;Jun-Zhe Li;;Xin-Min Ruan;;Dan-Ping Xu;;Dong-Qun Lin.European Journal of Pharmacology.2018

[3]CaMKII is a nodal signal for multiple programmed cell death pathways in heart[J].Ning Feng;;Mark E.Anderson.Journal of Molecular and Cellular Cardiology.2017

[4]Structure-Functional Basis of Ion Transport in Sodium–Calcium Exchanger(NCX)Proteins[J].Moshe Giladi;;Reut Shor;;Michal Lisnyansky;;Daniel Khananshvili.International Journal of Molecular Sciences.2016

[5]趙美英.參芪健心方對慢性心力衰竭模型大鼠心功能及鈣調(diào)節(jié)蛋白水平的影響[D].安徽中醫(yī)藥大學(xué),2021.