概述

6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯是一種化學(xué)式為C₁₄H₁₆N₂O₆，分子量308.2866的化學(xué)品，常溫常壓下為白色或者灰白色固體,具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性，對水和空氣都有一定的敏感性。該物質(zhì)的部分物性數(shù)據(jù)如下：密度1.404 g/cm³，沸點(diǎn)480.65 ℃，閃點(diǎn)244.49 ℃。

合成工藝

N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酸(SM1)與四醋酸鉛反應(yīng)得乙酸(N-[(9H-芴-9-基)甲氧基羰基]甘氨?；被?甲酯(M1)，反應(yīng)溶劑革除文獻(xiàn)的甲苯，無水四氫呋喃用量由27倍體積減為15倍體積。后處理革除柱層析，經(jīng)簡單的洗滌純度96.00%以上，三批收率90.0～93.0%。M1與乙醇酸芐酯發(fā)生親核取代反應(yīng)得M2，減少乙醇酸芐酯的投料量至8eq，反應(yīng)溶劑由DCM改為THF，革除柱色譜純化，使用二氯甲烷低溫析出，純度97.00%以上。馬來酰亞胺基己酸(SM2)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)縮合得6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯(M4)，革除柱層析，直接正丁醇析出，純度98.00%以上[1]。

應(yīng)用

以PEG2000為初始原料，通過與小分子的反應(yīng)，將其一端羥基保留，得到NH₂-PEG2000-OH，然后將NH₂-PEG2000-OH與6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，得到單端馬來酰亞胺基修飾的聚乙二醇(Mal-(CH₂)₅-CONH-PEG2000-OH)。通過這條合成路線能夠成功得到單端馬來酰亞胺基功能化的聚乙二醇[2]。

文獻(xiàn)公開了一種半抗原碘代甲狀腺素馬來酰亞胺活性偶聯(lián)試劑的制備方法。具體地，將碘代甲狀腺素加入到反應(yīng)溶劑中，將堿性溶液與碘代甲狀腺素的有機(jī)懸浮液混合，制備得到碘代甲狀腺素的弱堿性溶液；將6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯溶于所述反應(yīng)溶劑中并與所述碘代甲狀腺素的弱堿性溶液反應(yīng)，合成產(chǎn)品。上述制備方法具有原料價(jià)格低廉易得，合成步驟少，操作簡單，提取純化方便，收率高的優(yōu)點(diǎn)，有利于解決小分子半抗原在制備單克隆抗體中合成人工抗原關(guān)鍵原料以及在開發(fā)臨床檢測甲功項(xiàng)目試劑盒中關(guān)鍵原料的問題[3]。

有關(guān)研究

6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯是合成維布妥昔單抗的重要原料。維布妥昔單抗(Adcetris)是由美國西雅圖遺傳學(xué)公司和日本武田公司聯(lián)合開發(fā)的一種抗體偶聯(lián)藥物(ADC)。它的結(jié)構(gòu)由抗腫瘤抗原CD30的特異性抗體c AC10，可斷裂型二肽連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP，小分子毒性藥物單甲基澳瑞他汀E(MMAE)組成，主要用于霍杰金淋巴瘤和系統(tǒng)性間變性大細(xì)胞淋巴瘤的治療。我國研究人員通過對Adcetris結(jié)構(gòu)中的連接子部分進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)與試驗(yàn)得到一條穩(wěn)定，高收率，符合綠色化學(xué)要求，適合工業(yè)化生產(chǎn)的合成工藝，為后續(xù)Adcetris仿制藥及具有相同連接子ADC的研發(fā)提供參考，達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目標(biāo)。

首先，通過比對分析連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP的現(xiàn)有合成工藝，選擇出一條較優(yōu)的合成路線。該路線以N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-L-纈氨酸-2,5-二氧代-1-吡咯烷基酯(Fmoc-Val-OSu)為起始原料，先與瓜氨酸發(fā)生氨解反應(yīng)；在2-乙氧基-1(2H)-喹啉羧酸乙酯(EEDQ)的作用下與對氨基苯甲醇發(fā)生酰胺化反應(yīng)，連接一個(gè)可自發(fā)消除的間隔基；再以二乙胺做有機(jī)堿去除纈氨酸上的Fmoc保護(hù)基；將暴露出的N端與6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯(Mc-OSu)發(fā)生氨解反應(yīng)；再與二(對硝基苯)碳酸酯發(fā)生酯交換反應(yīng)得目標(biāo)化合物。通過單因素試驗(yàn)對各步反應(yīng)時(shí)間，中間體純化方式，投料量比，有機(jī)堿的使用，目標(biāo)化合物合成中所使用的試劑及純化方式等條件進(jìn)行優(yōu)化，使產(chǎn)品的純度和收率均得到提高。接著將起始原料的投料量提高至100 g，通過放大試驗(yàn)對優(yōu)化的合成工藝進(jìn)行驗(yàn)證。隨后，通過方法學(xué)考察驗(yàn)證連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP含量測定選擇的HPLC色譜條件和方法。最后，將得到的連接子與MMAE模型化合物反應(yīng)，確定連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP與小分子毒性藥物偶聯(lián)反應(yīng)的條件。

通過1H NMR，13C NMR，IR和HRMS方法確證小試，放大試驗(yàn)得到的終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP，含量為99.2%。其中，當(dāng)投料規(guī)模為100 g時(shí)合成工藝總收率穩(wěn)定，可達(dá)28.3%。HPLC測定含量的方法條件為：采用C(18)色譜柱，流動(dòng)相為V(乙腈):V(水)=50:50，進(jìn)樣體積為20μL，柱溫為30℃，檢測波長為254 nm。確定連接子與小分子毒性藥物的偶聯(lián)條件為：投料比n(Mc-Val-Cit-PABC-PNP):n(HOBt):n(小分子毒性藥物):n(DIPEA)=1.0:1.0:1.1:2.0，室溫反應(yīng)過夜。上述以6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯等物質(zhì)為原料的合成工藝避免了危化品，劇毒品的使用，與原研路線相比條件溫和，操作簡便，產(chǎn)物的純度高并且收率穩(wěn)定，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)方法學(xué)考察，以HPLC進(jìn)行連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP含量測定的色譜條件線性關(guān)系良好，回收率，精密度，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)均滿足《中國藥典》對采用HPLC做含量測定的要求。連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP與MMAE模型化合物的偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)物經(jīng)結(jié)構(gòu)確證為預(yù)期化合物，采用的連接子與小分子毒性藥物的偶聯(lián)條件可行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為Adcetris仿制藥的研究提供基礎(chǔ)和依據(jù)，同時(shí)，對具有相同連接子的其它ADC的合成與研發(fā)具有促進(jìn)作用[4]。

參考文獻(xiàn)

[1]路芳芳.ADC肽類連接子的合成工藝及其與抗體和毒素的偶聯(lián)[D].中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院,2023.

[2]王婷,孟慶斌,王晨宏,等.單端馬來酰亞胺基功能化聚乙二醇的制備[J].應(yīng)用化工, 2012, 41(3):5.DOI:10.3969/j.issn.1671-3206.2012.03.020.

[3]張冬冬,陳梁.一種半抗原碘代甲狀腺素馬來酰亞胺活性偶聯(lián)試劑的制備方法:CN202110855626.0[P].CN202110855626.0.

[4]楊柳.抗體偶聯(lián)藥物連接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP的合成與優(yōu)化[D].長春中醫(yī)藥大學(xué),2023.