背景[1-7]
細(xì)胞自噬檢測服務(wù)用于研究多種因素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬如饑餓、生長因子缺乏、微生物感染、細(xì)胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等。但是關(guān)于自噬信號的傳遞，現(xiàn)有的研究只明確了幾種信號通路，包括抑制類和激活類，但具體的機(jī)制尚在研究中。
自噬（Autophagy），或稱自體吞噬，是一個涉及到細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)通過溶酶體機(jī)制而被分解的過程，該過程是一個受到緊密調(diào)控的步驟，幫助細(xì)胞產(chǎn)物在合成、降解以及接下來的循環(huán)中保持一個平衡狀態(tài)。細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號后，在胞漿的某處形成一個扁平的類似“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu)，稱為Phagophore。隨著Phagophore不斷延伸，將胞漿中的細(xì)胞器等成分，全部包裹住成為密閉的結(jié)構(gòu)，稱為“自噬體（autophagosome）”。
自噬體形成后，可與溶酶體融合，自噬體中的內(nèi)容物隨即被降解，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘渣或被排出細(xì)胞外或滯留在胞漿中。自噬（Autophagy）是一類細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)降解的代謝過程，待降解的胞內(nèi)物質(zhì)首先被自噬小泡包裹，隨后被溶酶體中的水解酶降解。研究發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白輕鏈3（MAP-LC3），簡稱LC3，參與了自噬的形成，并被證明了是哺乳動物細(xì)胞中常見的自噬小體標(biāo)記蛋白之一。
Western blot可能會檢測到LC3的兩種形式，這是由于自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），這兩種形式在正常細(xì)胞中都是存在的，而發(fā)生自噬的細(xì)胞中LC3-II會有明顯的增加。
自噬主要是通過ULK complex磷酸化Beclin-1，激活脂酶VPS34，誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬發(fā)生，因此可以通過ULK complex和Beclin-1的相關(guān)基因的抑制劑來抑制自噬的形成，包括的靶點有MAP kinases,JNK1,ERK和p38。同時，細(xì)胞自噬還涉及了多種信號通路，如哺乳動物雷帕霉素靶點mTOR信號通路，是依賴mTOR的相關(guān)信號通路形成自噬的重要途徑。
另外，其它信號通路中，如3-甲基腺嘌呤（3-MA）可以通過抑制ClassⅢPI3K的活性抑制自噬；GTP結(jié)合的G蛋白亞基Gαi3抑制自噬；GDP結(jié)合的Gαi3蛋白活化自噬；死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein linase,DAPK）和DAPK相關(guān)蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）誘導(dǎo)自噬。PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium途徑也在自噬錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)格中，但其機(jī)制還不甚清楚。自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的細(xì)胞后直觀地觀察細(xì)胞自噬的整體水平；
1.GFP-LC3病毒系統(tǒng)：可高效感染目的細(xì)胞，表達(dá)GFP-LC3，感染感染后細(xì)胞可在熒光顯微鏡下實時觀察自噬的整體水平；
2.自噬LC3雙標(biāo)腺病毒：mRFP-GFP-LC3腺病毒系統(tǒng)，可高效感染目的細(xì)胞，表達(dá)mRFP-GFP-LC3，感染后細(xì)胞可在熒光顯微鏡下實時觀察自噬發(fā)生過程；
3.自噬LC3雙標(biāo)慢病毒：mRFP-GFP-LC3慢病毒系統(tǒng)，可以穩(wěn)定表達(dá)持續(xù)檢測細(xì)胞的自噬流檢測；
4.AAV在體自噬流檢測：最有效的在體自噬流檢測工具，AAV-mRFP-GFP-LC3
應(yīng)用[8][9]
細(xì)胞自噬檢測服務(wù)可用于研究癌癥應(yīng)激性死亡中的作用：
在細(xì)胞自噬在肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性死亡中的作用及對藥物敏感性研究中，肝癌細(xì)胞始終處于病毒感染、營養(yǎng)缺乏、炎癥刺激等各種不良的微環(huán)境中,這些不良刺激加上腫瘤的惡性增殖會使得大量未折疊／錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的積聚,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)狀態(tài)。研究證實,ERS以及其引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)與眾多的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān),因此探討ERS狀態(tài)下的肝癌細(xì)胞增殖、生存和死亡的機(jī)制具有重要的意義。
自噬是細(xì)胞在缺氧、營養(yǎng)缺乏環(huán)境下通過自身降解來維持生存和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。近年研究表明,自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的治療均有密切關(guān)系,但自噬究竟是發(fā)揮促癌還是抑癌的作用目前尚無定論。研究ERS狀態(tài)下肝癌細(xì)胞的自噬活性的變化,以及自噬在肝癌細(xì)胞生存和死亡中的作用有助于進(jìn)一步闡明肝癌的惡性生物學(xué)的分子基礎(chǔ)和藥物抵抗機(jī)制。
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