背景[1-6]
Caspase-3抗體(兔多抗)用人工合成的人Caspase-3本身的切割位點(diǎn)處一段多肽，經(jīng)適當(dāng)修飾后免疫兔子，然后用protein A和抗原多肽親和柱經(jīng)過兩步純化得到的高純度多克隆抗體。Caspase-3抗體可以識別全長的Caspase-3(35kD)，也可以識別Caspase-3被剪切后產(chǎn)生的17kD片段。未發(fā)現(xiàn)和其它Caspase家族蛋白有交叉反應(yīng)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子(key executioner)之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白，例如PARP。
Caspase-3的激活需要從沒有活性的全長Caspase-3(35kD)，在Asp28和Ser29之間及Asp175和Ser176之間進(jìn)行剪切，產(chǎn)生有活性的17kD肽段。Caspase-3的激活常被作為細(xì)胞凋亡的一個重要指標(biāo)。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動形成的一種自我死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用。
大量的光鏡及超微結(jié)構(gòu)的研究分析證明哺乳動物附植前的胚胎就可以觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生，胚胎細(xì)胞的凋亡有利于胚胎去除發(fā)育異常的細(xì)胞，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)育的停滯相關(guān)，超出某一程度的凋亡不利于胚胎的發(fā)育。因此研究著床前胚胎細(xì)胞的凋亡將有助于正確理解胚胎的發(fā)育過程，改進(jìn)體外培養(yǎng)體系，提高胚胎質(zhì)量，解決哺乳動物胚胎流產(chǎn)率高的問題。
半胱天冬酶家族(Caspase)能夠啟動和維持細(xì)胞凋亡，而其成員Caspase-3是該細(xì)胞凋亡通路下游最重要的凋亡蛋白酶，其表達(dá)量直接反映細(xì)胞凋亡程度。Caspase-3是位于哺乳動物細(xì)胞凋亡通路下游關(guān)鍵的死亡蛋白酶。正常情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的酶原形存在，細(xì)胞凋亡信號的出現(xiàn)可導(dǎo)致Caspase-3裂解、活化，活化的Caspase-3又進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞走向死亡。因此Caspase-3表達(dá)量可以直接反映細(xì)胞凋亡程度。細(xì)胞凋亡程度Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子(key executioner)之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白，例如PARP。
Caspase-3的激活需要從沒有活性的全長Caspase-3(35kD)，在Asp28和Ser29之間及Asp175和Ser176之間進(jìn)行剪切，產(chǎn)生有活性的17kD肽段。Caspase-3抗體可以識別全長的Caspase-3(35kD)，也可以識別Caspase-3被剪切后產(chǎn)生的17kD片斷。未發(fā)現(xiàn)和其它Caspase家族蛋白有交叉反應(yīng)。
應(yīng)用[7][8]
Caspase-3抗體可用于制備AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒。
所述試劑盒包括：0.6-0.8%BSA的PBS緩沖液，2.5-4%多聚甲醛的PBS緩沖液，含0.6-0.8%Triton-X-100和0.06-0.08%吐溫40的PBS緩沖液，兔抗caspase-3抗體，帶有Alexa-Fluor488綠色熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，18-22μM-DAPI的PBS緩沖液。所述兔抗caspase-3抗體是用合成的caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端殘基的多肽抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體；兔抗caspase-3抗體按1:600的體積比稀釋于封閉液中。
所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的體積比稀釋于封閉液中；其中，所述封閉液為含10%山羊血清和0.06-0.08%吐溫40的PBS液。上述試劑盒能對凋亡細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量檢測，靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡單，重復(fù)性好，效率高。在研究肌醇六磷酸(IP6)對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的誘導(dǎo)凋亡作用,檢測Caspase3基因在IP6處理細(xì)胞前后表達(dá)的變化,并對IP6誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡機(jī)制進(jìn)行初步探討。
方法不同濃度的IP6以不同時間作用于體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞,用MTT法檢測IP6持續(xù)作用對癌細(xì)胞增殖的影響;透射電鏡觀察癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;用RT-PCR方法對IP6作用前后以及作用不同濃度和時間的癌細(xì)胞內(nèi)Caspase3活性進(jìn)行檢測。結(jié)果IP6能顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29生長,呈劑量與時間依賴性;IP6作用后,HT-29細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變;與對照組相比,不同濃度的IP6作用不同時間后,Caspase3 mRNA表達(dá)均升高(F=8.173~91.755,q=3.960~17.095,P<0.05),IP6作用6個月組Caspase3 mRNA表達(dá)升高較其他時間組顯著(q=12.858~14.890,P<0.01)。
參考文獻(xiàn)
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[8]Recent advances on neuronal caspase in development and neurodegeneration.Marks N,Berg MJ.Neurochemistry International.1999