背景及概述^[1]

腸激酶( Enterokinase，EK，EC3.4.21.9) 是一種異源二聚體形式存在于哺乳動物十二指腸內(nèi)的絲氨酸蛋白酶。它能高效專一性的水解工程菌表達的融合蛋白（識別位點 是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）釋放出目的蛋白，被廣泛用于生物工程制藥的開發(fā)。牛腸激酶由 一條結(jié)構(gòu)亞基（重鏈）和一條催化亞基（輕鏈）構(gòu)成，二者以二硫鍵結(jié)合。據(jù)報道，重組腸激酶輕鏈體外具有全酶的酶切特異性，同時對基因工程融合蛋白底物的酶切活性較提純的牛腸激酶明顯增強。天然腸激酶來源有限，且從動物組織提取的腸激酶易污染其他蛋白，給實際應(yīng)用帶來了困難。這就要求用基因工程方法生產(chǎn)高純度的腸激酶。重組腸激酶可以切割含有四個天冬氨酸的賴氨酸羧基端肽鍵：天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 賴氨酸（DDDDK）。可以在較寬pH范圍（4.5-9.5）和較寬溫度范圍內(nèi)有效切割融合蛋白。重組腸激酶可去除位于蛋白質(zhì)N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合標(biāo)簽。

產(chǎn)品特性

單位定義：1U定義為在25℃，12h~16h之內(nèi)，將0.5mg保存于25mM Tris-HCl 8.0 緩沖液中的融合蛋白切割95%所需的酶量。

推薦使用方法

1）25℃酶切條件：

按照酶活性定義，酶切條件舉例：

25mM Tris-HCl 8.0體系中：

融合蛋白  0.1-1mg/ml（蛋白總量50-100µg）

重組EK   0.1-0.2U

25℃過夜酶切，或完全酶切需16-24h，用SDS-PAGE檢測酶切效果。

2）4℃低溫酶切條件：

4℃能對底物進行有效酶切，但需要將酶切時間延長至48-64h，或增加2-3倍酶量。

3）酶切優(yōu)化和放大

優(yōu)化：可以對酶切條件進行優(yōu)化，例如緩沖液pH，融合蛋白濃度，EK的量，以及酶切時間，使融合蛋白能在穩(wěn)定條件下被酶切，用SDS-PAGE檢測酶切效果。

放大：選擇優(yōu)化后的反應(yīng)條件，按該條件等比例放大，用SDS-PAGE檢測酶切效果。

4）去除重組腸激酶的方法：使用胰蛋白酶抑制劑親和層析（例如sigma T0637）去除重組腸激酶。

5）注意：不建議37℃條件下酶切，可能會有非特異性酶切出現(xiàn)。

常見影響腸激酶活性的因素

在＞200mM 咪唑，或＞200mMNaCl，或＞5%甘油，酶切效果受影響?？蓞⒄找韵峦扑]方法進行酶切：

1）為獲得理想酶切結(jié)果，請將樣品透析到25mM Tris-HCl 8.0緩沖液中，再進行酶切。

2）若不便透析，可將樣品稀釋，咪唑含量在100mM以下，NaCl濃度在50mM以下，甘油濃度小于5%以下進行酶切，酶的用量與蛋白的比例不變（即1U酶切500µg蛋白）。

3）如果樣品溶液中含有上述成分中的一種或多種，且不便去除，此時適當(dāng)增加酶量或延長酶切時間，也可達到較好酶切效果。

儲存和運輸穩(wěn)定性

酶液儲存穩(wěn)定性：-20℃，24個月穩(wěn)定；25℃，一周內(nèi)，無活性損失。緩沖體系：50mM Tris-HCl，pH8.0，250mM NaCl，2mMCa2+，50%甘油。

酶液反復(fù)凍融穩(wěn)定性：反復(fù)凍融5次，無活性損失。

運輸穩(wěn)定性：藍冰保溫運輸，穩(wěn)定。

制備^[1]

一種制備重組腸激酶的方法，該方法包括：

（1）重組表達融合蛋白，所述融合蛋白序列從N端到C端依次包括：100-250個氨基酸序列、腸激酶序列；

（2）切除融合蛋白N端所述的100-250個氨基酸序列獲得重組腸激酶，所述重組腸激酶的氨基酸序列為Seq ID No.1，核苷酸序列為Seq ID No.4。

主要參考文獻

[1] CN201611258115.6 一種重組腸激酶的制備方法