背景[1-3]
小鼠角膜上皮細(xì)胞采用酶解法制備而來，CK-18、CK-19免疫熒光鑒定呈陽性，細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
小鼠角膜上皮細(xì)胞是一種常用的細(xì)胞模型，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。這些細(xì)胞可以用于研究角膜疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和細(xì)胞替代治療等。
在體外培養(yǎng)小鼠角膜上皮細(xì)胞時(shí)，需要提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，包括特定的培養(yǎng)基、血清、生長(zhǎng)因子等。這些細(xì)胞通常會(huì)在傳代后逐漸失去原有的細(xì)胞形態(tài)和功能，因此需要進(jìn)行及時(shí)更換。
為了保證細(xì)胞的純度和質(zhì)量，需要進(jìn)行細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物檢測(cè)和微生物檢測(cè)等質(zhì)量控制措施。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)小鼠角膜上皮細(xì)胞時(shí)，也需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的操作和管理，以避免交叉感染和保證細(xì)胞的可靠性。
小鼠角膜上皮細(xì)胞
小鼠角膜上皮細(xì)胞復(fù)蘇操作：
1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2）將凍存小鼠角膜上皮細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BIU-87(人膀胱癌細(xì)胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5）將小鼠角膜上皮細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
應(yīng)用[4-5]
小鼠角膜上皮細(xì)胞可以用于新型小分子復(fù)合物對(duì)小鼠角膜上皮細(xì)胞體外擴(kuò)增的作用
探究六種小分子化合物(six chemicals,6C)在無血清無滋養(yǎng)層條件下,對(duì)原代小鼠角膜上皮細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞分化表型的影響,并以此開發(fā)構(gòu)建組織工程小鼠角膜上皮植片。
方法:原代小鼠角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加不同的化合物組合,在經(jīng)過傳代/連續(xù)培養(yǎng)后,通過結(jié)晶紫染色、生長(zhǎng)曲線和克隆形成效率評(píng)估原代小鼠角膜上皮細(xì)胞的增殖活性;通過免疫熒光染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析原代小鼠角膜上皮細(xì)胞和上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相關(guān)基因的表達(dá);在小鼠角膜上皮損傷愈合模型中,以6C組分溶液進(jìn)行點(diǎn)眼處理,通過熒光素鈉染色評(píng)估角膜上皮愈合速度;在空氣暴露培養(yǎng)體系中添加不同小分子組分,通過對(duì)培養(yǎng)形成的角膜上皮植片進(jìn)行免疫染色,評(píng)估植片中上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和表型分化。
結(jié)果:在長(zhǎng)期培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)中,6C復(fù)合物增加了原代小鼠角膜上皮細(xì)胞的增殖活性。在體實(shí)驗(yàn)顯示6C能夠加速小鼠角膜上皮傷口的愈合。
同時(shí),這種復(fù)合物抑制了EMT相關(guān)標(biāo)記物ZEB1/2、Snail、β-catenin和α-SMA等表達(dá)水平的增加,而與此同時(shí),維持了原代小鼠角膜上皮細(xì)胞功能相關(guān)標(biāo)記物p63、K14、Pax6和K12等的表達(dá)。6C復(fù)合物的這種保護(hù)作用表明,它可以通過延長(zhǎng)功能性干/祖細(xì)胞活性的壽命來減少其向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。
此外,在空氣暴露培養(yǎng)體系中添加6C復(fù)合物,可形成可用于移植手術(shù)的組織工程小鼠角膜上皮片。
結(jié)論:6C復(fù)合物既抑制了原代小鼠角膜上皮細(xì)胞增殖活性的傳代依賴性下降,又抑制了EMT的增加。這些影響表明,這種新型6C復(fù)合物可能有助于改善角膜緣干細(xì)胞缺乏癥的治療。
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