背景[1-3]
JM109感受態(tài)細胞來源于E.coli K strain，是提取高質(zhì)量DNA的理想菌株，recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。攜帶hsdR17基因型背景，使得異源DNA不被內(nèi)源核酸酶系統(tǒng)降解。laqI qZΔM15的存在使JM109可用于構(gòu)建克隆，藍白斑篩選實驗；High5TM系列JM109感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×109cfu/μg。
JM109感受態(tài)細胞
JM109感受態(tài)細胞源自于JM109,它含有T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝。如果克隆至載體上的基因包含了核糖體結(jié)合位點，JM109(DE3)就可以對位于T7啟動子下游的基因序列進行高水平的表達。但是要注意的是JM109(DE3)不能用于藍白斑實驗，JM109(DE3)采用經(jīng)常使用的LB培養(yǎng)基，在37℃有氧的條件下培養(yǎng)，然后使用20%甘油，在-80℃的條件下進行菌種保藏。JM109(DE3)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒采用的是42℃熱激處理的方法。
使用方法
1.取感受態(tài)細胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100μl，可以根據(jù)實際情況分裝使用。以下實驗以50μl感受態(tài)細胞為例。
2.待感受態(tài)細胞融化后，向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA（根據(jù)實際情況加入適量的DNA，通常100μl感受態(tài)細胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。
3.42℃熱擊90秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。
4.每個離心管中加入450μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床，150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘使菌體復(fù)蘇。
5. 根據(jù)實驗需求，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，加到含相應(yīng)抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于37℃直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12-16小時。
應(yīng)用[4][5]
用于OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在肺癌中表達的定量研究及意義研究
建立用熒光定量RT—PCR法檢測肺癌組織中人類有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（organic anion transporting polypeptide,OATP）B和D mRNA的表達,并用免疫組化及圖像分析技術(shù)定量分析肺癌組織中蛋白表達水平,分析其mRNA及蛋白表達與病理分型等臨床資料的關(guān)系。
方法；1.熒光定量PCR標準曲線的建立及優(yōu)化:（1）組織總RNA提取:用Tiozol試劑分別提取不同病理分型肺癌組織和正常肺組織中的總RNA。（2）cDNA的合成:以所提取的組織的總RNA為原料進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得cDNA。（3）PCR反應(yīng)及重組質(zhì)粒的構(gòu)建:以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進行普通PCR擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進行純化。用PGEM-T Easy質(zhì)粒載體連接PCR純化產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,藍白斑篩選重組質(zhì)粒。（4）標準曲線的建立及優(yōu)化:優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件,以重組質(zhì)粒為標準品建立檢測OATP mRNA的標準曲線,并以此對40例肺癌標本中OATP-B和OATP-D mRNA的含量進行測定。
2. 免疫組化:采用鏈霉親和素—過氧化酶法（S—P法）,DAB顯色液顯色,以抗OATP-B和抗OATP-D為一抗,PBS作為陰性對照,鑒定肺癌中OATP-B和OATP-D蛋白的表達。用IPP4.0圖像分析軟件對免疫組化結(jié)果進行分析。
3. 臨床資料分析:結(jié)合臨床資料,分析OATP-B和OATP-D的mRNA及蛋白表達與病理分型、性別、年齡、腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。
4. 統(tǒng)計學分析:采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件包對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)均用（?）±S表示,多組均數(shù)間的比較采用方差分析,多組均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05,差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果：構(gòu)建了OATP基因的重組質(zhì)粒,并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,經(jīng)藍白斑篩選提取重組質(zhì)粒,對質(zhì)粒進行梯度稀釋,以稀釋的質(zhì)粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件,建立定量檢測OATP-B和OATP-D mRNA的熒光定量PCR體系。熒光定量PCR結(jié)果顯示,OATP-B和OATP-D的mRNA在不同病理分型肺癌中表達上調(diào),P＜0.05,差異有統(tǒng)計學意義;OATP-B和OATP-D的mRNA在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中的表達差異有統(tǒng)計學意義,P＜0.05。免疫組化法顯示,與正常肺組織相比,OATP-B和OATP-D蛋白在不同病理分型肺癌中高表達,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學意義;OATP-B和OATP-D蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中的表達明顯無高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學意義。OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在不同病理分型、性別、年齡及不同大小肺癌標本間的表達無統(tǒng)計學差異,P＞0.05。
結(jié)論：1.建立并優(yōu)化檢測OATP-B和OATP-DmRNA表達的熒光定量PCR體系。
2.OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在不同病理分型肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中均高表達;OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白的表達與肺癌標本的不同病理分型、性別、年齡及大小無關(guān)。提示OATP-B和OATP-D在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,一方面可能為腫瘤發(fā)生及藥物治療的分子機制提出新的理論,另一方面為其他腫瘤多種基因的大規(guī)模臨床檢測提供了迅速可靠的mRNA熒光定量方法。
參考文獻
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