背景^[1-4]

JM109感受態(tài)細(xì)胞是通過理化方法誘導(dǎo)JM109細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的狀態(tài)。JM109感受態(tài)細(xì)胞是通過處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動性，這種孔洞會被細(xì)胞自身所修復(fù)。

制備方法

CaCl2法

1.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細(xì)胞膨脹，同時Ca2+會使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物。聯(lián)合其它的二價金屬離子（如Mn、Co）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高100～1000倍。

2.此時，將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。

3.將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。

電轉(zhuǎn)法

電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到109~1010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。

M109菌株來源于E.coli K strain，是提取高質(zhì)量DNA的理想菌株，recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。攜帶hsdR17基因型背景，使得異源DNA不被內(nèi)源核酸酶系統(tǒng)降解。laqI qZΔM15的存在使JM109可用于構(gòu)建克隆，藍(lán)白斑篩選實驗；

JM109感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)109cfu/μg DNA。

應(yīng)用^[5][6]

用于高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)用于三種常見遺傳性疾病分子診斷的研究

mtDNA12S rRNA基因PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，通過LB/Amp/IPTG/X-gal平板篩選白色克隆，載體通用引物對其進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增初步確定陽性克隆，并通過序列分析進(jìn)行確證，得到mtDNA12S rRNA基因的野生模板質(zhì)粒。反向PCR對其野生質(zhì)粒模板實施體外mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T定點突變，Dpn I內(nèi)切酶降解甲基化的野生質(zhì)粒DNA模板后，再次轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，同前篩選陽性克隆，測序鑒定得到mtDNA12SrRNA基因C1494T和A1555G突變質(zhì)粒模板。進(jìn)一步設(shè)計與mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T突變位點配對及三末端不配對的3’硫化修飾正向引物，在其下游設(shè)計一條公共反向引物，分別構(gòu)成野生檢測引物與突變檢測引物，對mtDNA12SrRNA基因野生質(zhì)粒模板和A1555G和C1494T突變質(zhì)粒模板，進(jìn)行高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的雙向引物延伸反應(yīng)，利用凝膠成像系統(tǒng)對其PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

參考文獻(xiàn)

[1]Mitochondrial 12S rRNA mutations associated with aminoglycoside ototoxicity.Min-Xin Guan.Mitochondrion.2011

[2]Language ability after early detection of permanent childhood hearing impairment.C.R.Kennedy,D.C.McCann,M.J.Campbell,C.M.Law,M.Mullee,S.Petrou,P.Watkin,S.Worsfold,H.M.Yuen,J.Stevenson.New England Journal of Homeopathy.2006

[3]Evidenceofgeneticheterogeneityinfivekindredswithfamilialhypertfophiccardiomyopathy.EpsteinND,FananapazirL,LinHJ,etal.Circulation.1992

[4]Pathogenesis of the deafness-associated A1555G mitochondrial DNA mutation.Giordano C,,Pallotti F,Walker WF,et al.Biochem　Biophys.Res.Commun.2002

[5]Quantitative mitochondrial DNAmutation analysis by denaturing HPLC.Lim KS,,Naviaux RK,Haas RH.Clinical Chemistry.2007

[6]郭紫芬.高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)用于三種常見遺傳性疾病分子診斷的研究[D].南華大學(xué),2011.