背景^[1-3]

人胃腺癌細胞源自一個未經(jīng)治療的切除腫瘤碎塊。在培養(yǎng)基中植板率為34%。

人胃腺癌細胞

細胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備F12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

應(yīng)用^[4][5]

用于迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株的影響及其分子機制研究

目的:（1）通過作用于人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901的體外研究,比較迷迭香酸和迷迭香酸類似物-11對細胞生長的抑制作用。（2）探究迷迭香酸類似物-11誘導人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901凋亡及其可能的機制。

方法:（1）MTT法檢測迷迭香酸和迷迭香酸類似物-11分別對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901增殖的抑制作用。

（2）平板細胞克隆形成試驗觀察迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901集落形成能力的影響。

（3）細胞劃痕實驗觀察迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901遷移能力的影響。

（4）Hoechst 33258染色法觀察迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901的凋亡形態(tài)學改變的影響。

（5）流式細胞術(shù)檢測迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901的早期凋亡和晚期凋亡的影響。

（6）熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901人表皮受體生長因子EGFR mRNA,凋亡相關(guān)基因Caspase-3 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達水平的影響。

（7）免疫印跡法（Western blot）檢測迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax相對表達量的影響。

（8）免疫印跡法（Western blot）檢測迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901通路蛋白EGFR及其下游Akt/NF-κB通路、MAPK經(jīng)典通路相關(guān)蛋白相對表達量的影響。

結(jié)果:1.迷迭香酸和迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901增殖的抑制作用:（1）迷迭香酸作用于MGC-803細胞24 h、36 h、48 h的IC50分別是175.792±1.406μmol·L-1、108.077±0.615μmol·L-1、68.282±1.349μmol·L-1。（2）迷迭香酸作用于SGC-7901細胞24 h、36 h、48 h的IC50分別是174.302±0.793μmol·L-1、124.547±2.287μmol·L-1、54.158±2.098μmol·L-1。（3）迷迭香酸類似物-11作用于MGC-803細胞24 h、36 h、48 h的IC50分別是72.781±0.975μmol·L-1、59.979±1.203μmol·L-1、40.625±0.623μmol·L-1。（4）迷迭香酸類似物-11作用SGC-7901細胞24 h、36h、48 h的IC50分別是73.299±2.011μmol·L-1、50.426±1.458μmol·L-1、37.684±0.579μmol·L-1。

2. 迷迭香酸類似物-11對人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901生物學功能的影響:（1）平板細胞克隆形成試驗可以看出,迷迭香酸類似物-11可顯著抑制人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901的集落形成能力,且呈濃度依賴性。（2）從細胞劃痕實驗得出,迷迭香酸類似物-11能時間濃度依賴性地抑制人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901的遷移能力。（3）Hoechst 33258染色法結(jié)果表明,不同濃度的迷迭香酸類似物-11干預人胃腺癌細胞株MGC-803和人胃腺癌細胞株SGC-7901 48 h后,細胞核呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學改變。（4）流式細胞術(shù)結(jié)果提示,迷迭香酸類似物-11作用于MGC-803細胞48 h后,低濃度組主要誘導MGC-803細胞晚期凋亡,而中、高濃度組均能誘導MGC-803細胞早期凋亡和晚期凋亡;迷迭香酸類似物-11作用于SGC-7901細胞48 h后,低、中濃度組主要誘導SGC-7901細胞早期凋亡,而高濃度組能誘導SGC-7901細胞早期凋亡和晚期凋亡。

參考文獻

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