背景^[1-3]

人胃腺癌細(xì)胞源自一個(gè)未經(jīng)治療的切除腫瘤碎塊。在培養(yǎng)基中植板率為34%。

人胃腺癌細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備F12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

應(yīng)用^[4][5]

用于迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株的影響及其分子機(jī)制研究

目的:（1）通過(guò)作用于人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901的體外研究,比較迷迭香酸和迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。（2）探究迷迭香酸類(lèi)似物-11誘導(dǎo)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡及其可能的機(jī)制。

方法:（1）MTT法檢測(cè)迷迭香酸和迷迭香酸類(lèi)似物-11分別對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901增殖的抑制作用。

（2）平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)觀察迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901集落形成能力的影響。

（3）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901遷移能力的影響。

（4）Hoechst 33258染色法觀察迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901的凋亡形態(tài)學(xué)改變的影響。

（5）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901的早期凋亡和晚期凋亡的影響。

（6）熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901人表皮受體生長(zhǎng)因子EGFR mRNA,凋亡相關(guān)基因Caspase-3 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)水平的影響。

（7）免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量的影響。

（8）免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901通路蛋白EGFR及其下游Akt/NF-κB通路、MAPK經(jīng)典通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響。

結(jié)果:1.迷迭香酸和迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901增殖的抑制作用:（1）迷迭香酸作用于MGC-803細(xì)胞24 h、36 h、48 h的IC50分別是175.792±1.406μmol·L-1、108.077±0.615μmol·L-1、68.282±1.349μmol·L-1。（2）迷迭香酸作用于SGC-7901細(xì)胞24 h、36 h、48 h的IC50分別是174.302±0.793μmol·L-1、124.547±2.287μmol·L-1、54.158±2.098μmol·L-1。（3）迷迭香酸類(lèi)似物-11作用于MGC-803細(xì)胞24 h、36 h、48 h的IC50分別是72.781±0.975μmol·L-1、59.979±1.203μmol·L-1、40.625±0.623μmol·L-1。（4）迷迭香酸類(lèi)似物-11作用SGC-7901細(xì)胞24 h、36h、48 h的IC50分別是73.299±2.011μmol·L-1、50.426±1.458μmol·L-1、37.684±0.579μmol·L-1。

2. 迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901生物學(xué)功能的影響:（1）平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)可以看出,迷迭香酸類(lèi)似物-11可顯著抑制人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901的集落形成能力,且呈濃度依賴(lài)性。（2）從細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)得出,迷迭香酸類(lèi)似物-11能時(shí)間濃度依賴(lài)性地抑制人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901的遷移能力。（3）Hoechst 33258染色法結(jié)果表明,不同濃度的迷迭香酸類(lèi)似物-11干預(yù)人胃腺癌細(xì)胞株MGC-803和人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901 48 h后,細(xì)胞核呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)改變。（4）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示,迷迭香酸類(lèi)似物-11作用于MGC-803細(xì)胞48 h后,低濃度組主要誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞晚期凋亡,而中、高濃度組均能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡;迷迭香酸類(lèi)似物-11作用于SGC-7901細(xì)胞48 h后,低、中濃度組主要誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞早期凋亡,而高濃度組能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡。

參考文獻(xiàn)

[1]Targeting Mcl-1 and Other Bcl-2 Family Member Proteins in Cancer Therapy[J].Ryuji Yamaguchi,Lydia Lartigue,Guy Perkins.Pharmacology and Therapeutics.2018

[2]Xanthohumol induces apoptosis via caspase activation,regulation of Bcl-2,and inhibition of PI3K/Akt/mTOR-kinase in human gastric cancer cells[J].Dongli Guo,Baogui Zhang,Shiqi Liu,Meng Jin.Biomedicine＆Pharmacotherapy.2018

[3]Pharmacological and biotechnological advances with Rosmarinus officinalis L[J].Neves,Neves,Oliveira.Expert Opinion on Therapeutic Patents.2018(5)

[4]lncRNA LINC00152 knockdown had effects to suppress biological activity of lung cancer via EGFR/PI3K/AKT pathway[J].Yan Zhang,Cheng Xiang,Yuling Wang,Yuanyuan Duan,Ci Liu,Yongli Jin,Yajing Zhang.Biomedicine＆Pharmacotherapy.2017

[5]李婉婷.迷迭香酸類(lèi)似物-11對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株的影響及其分子機(jī)制研究[D].廣西醫(yī)科大學(xué),2019.