背景^[1-3]

小鼠血清總補(bǔ)體是分離自小鼠抗凝血血清的免疫補(bǔ)體，主要用于檢測(cè)小鼠模型的免疫研究。

補(bǔ)體是一種血清蛋白質(zhì)，存在于人和脊椎動(dòng)物血清及組織液中，不耐熱，活化后具有酶活性、可介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)?？杀豢乖?抗體復(fù)合物或微生物所激活，導(dǎo)致病原微生物裂解或被吞噬?？赏ㄟ^(guò)三條既獨(dú)立又交叉的途徑被激活，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑。

脊椎動(dòng)物血液或新鮮制備的血清中存在的血清蛋白質(zhì)系統(tǒng)，由血漿補(bǔ)體成分、可溶性和膜型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、補(bǔ)體受體等30余種糖蛋白組成，是一個(gè)具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)，或多分子系統(tǒng)，包括可溶性蛋白、膜結(jié)合性蛋白和補(bǔ)體受體，故稱(chēng)為補(bǔ)體系統(tǒng)。根據(jù)補(bǔ)體系統(tǒng)各成分的生物學(xué)功能，可將其分為補(bǔ)體固有成分、補(bǔ)體調(diào)控成分和補(bǔ)體受體(CR)。

小鼠血清總補(bǔ)體

補(bǔ)體C3（C3）和補(bǔ)體C4（C4）在血清中的含量高于其他補(bǔ)體分子，二者在完成補(bǔ)體系統(tǒng)的多種功能中具有十分重要的作用，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定對(duì)于疾病的診斷、治療和病因探討具有重要作用。C3正常參考值為0.9～1.8 g/L，C3增高常見(jiàn)于各種傳染病、急性炎癥和組織損傷、急性腎炎、肝癌等，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者正?；蚵杂猩?。C3降低常見(jiàn)于：免疫復(fù)合物引起的增殖性慢性腎小球腎炎（MPGN）、急性鏈球菌感染后腎小球腎炎（AGN）、狼瘡性腎炎、反復(fù)性感染、皮疹、肝炎、肝硬化等嚴(yán)重肝臟疾患和關(guān)節(jié)疼痛等。C4正常參考值為0.1～0.4 g/L，C4增高常見(jiàn)于各種傳染病、急性腎炎、組織損傷、多發(fā)性骨髓瘤等。C4降低常見(jiàn)于免疫復(fù)合物引起的腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒性感染、狼瘡性癥候群、肝硬化、肝炎等。

應(yīng)用^[4][5]

用于東方田鼠補(bǔ)體C3和C5分子鑒定及C3靶向重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建研究

通過(guò)RACE及巢式PCR克隆了東方田鼠補(bǔ)體C3和C5完整基因序列?？寺〉臇|方田鼠C3基因ORF含4988bp,編碼1662個(gè)氨基酸。C3蛋白N端具有一個(gè)24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,沒(méi)有跨膜區(qū),是極不穩(wěn)定的親水性蛋白。C5蛋白由5481bp核酸編碼的1688個(gè)氨基酸組成,氨基端有25個(gè)AA組成的信號(hào)肽,是穩(wěn)定的親水性蛋白。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示C3蛋白有8個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域,C5蛋白有10個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域,二者結(jié)構(gòu)域相似,多為A2M家族的A2M、A2M＿N、A2M＿N＿2和MG1等,都存在過(guò)敏毒素ANATO結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析可知東方田鼠補(bǔ)體蛋白C3和C5均與草原田鼠的C3和C5蛋白親緣關(guān)系較近,兩種蛋白在進(jìn)化過(guò)程中比較保守。

應(yīng)用qPCR檢測(cè)C5分子在東方田鼠各主要器官的表達(dá)水平及C3和C5分子在東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。在正常的東方田鼠體內(nèi),C5在肝臟中表達(dá)最高。東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后1d,肝臟和肺臟組織C3表達(dá)水平迅速升高,比未感染組高約94%和72.9%,感染后7d和14d較未感染組降低,感染后21d和28d和未感染組比升高或接近。和未感染鼠相比,補(bǔ)體C5基因在感染1d和7d的肝臟和肺臟中表達(dá)水平升高,感染后第14d,表達(dá)水平降低,至21d和28d,兩者轉(zhuǎn)錄水平接近。

結(jié)果表明C3和C5在肺肝組織中隨感染進(jìn)程是升高-降低-回升（接近）的過(guò)程。東方田鼠感染尾蚴1 d、7 d、14 d、21 d、28 d和42 d的血清總補(bǔ)體活性CH50平均值分別為433 U/mL、395 U/mL、378 U/mL、411 U/mL、373 U/mL、555 U/mL和433 U/mL,結(jié)果表明東方田鼠感染血吸蟲(chóng)后血清補(bǔ)體活性沒(méi)有顯著變化。

根據(jù)東方田鼠補(bǔ)體C3基因序列設(shè)計(jì)C3靶向的3條ShRNA序列,構(gòu)建了3種重組腺相關(guān)病毒,病毒滴度為1011 GC/ml以上。rAAV8-sh RNA5-MfC3和scramble可以高效感染293T細(xì)胞,也可以感染Hepa1-6細(xì)胞,細(xì)胞感染后可見(jiàn)熒光信號(hào),結(jié)果表明構(gòu)建的重組病毒可以在肝細(xì)胞中表達(dá)。

Km鼠注射scramble與rAAV8-shRNA4-MfC3病毒4周后,其肝臟組織可見(jiàn)明顯的熒光信號(hào),腎臟組織中scramble有明顯熒光,rAAV8-shRNA4-MfC3的熒光信號(hào)較弱。定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,rAAV8-shRNA4-MfC3重組病毒可誘導(dǎo)肝臟C3表達(dá)量比scramble降低20.03%,4周后其抑制效率達(dá)62.70%（P<0.01）。結(jié)果表明,篩選到可抑制C3表達(dá)的重組腺相關(guān)病毒。

參考文獻(xiàn)

[1]Complement Components,C3 and C4,and the Metabolic Syndrome[J].Melanie Copenhaver,Chack-Yung Yu,Robert P.Hoffman.Current Diabetes Reviews.2019(1)

[2]Complement in cancer:untangling an intricate relationship.[J].Reis Edimara S,Mastellos Dimitrios C,Ricklin Daniel,Mantovani Alberto,Lambris John D.Nature reviews.Immunology.2018(1)

[3]Characterization of Schistosoma japonicum tetraspanning orphan receptor and its role in binding to complement C2 and immunoprotection against murine schistosomiasis.[J].Ma Shuai,Zai Jinli,Han Yanhui,Hong Yang,Zhang Min,Cao Xiaodan,Han Qian,Lu Ke,Zhao Zhixin,Lin Jiaojiao,Fu Zhiqiang.Parasites&vectors.2017(1)

[4]Immediate,Complete,and Sustained Inhibition of C5 with ALXN1210 Reduces Complement-Mediated Hemolysis in Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria（PNH）:Interim Analysis of a Dose-Escalation Study[J].Lee Jong Wook,Bachman Eric Scott,Aguzzi Rasha,Jang Jun Ho,Kim Jin Seok,Rottinghaus Scott T.,Shafner Lori,Szer Jeff.Blood.2016(22)

[5]黃明月.東方田鼠補(bǔ)體C3和C5分子鑒定及C3靶向重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2021.