背景[1-3]
AGL1 ELECTRO感受態(tài)細胞是以為C58,RecA型背景，核基因中含有篩選標簽—利福平抗性基因rif和羧芐青霉素抗性基因carb，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pTiBo542DT-DNA，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pTiBo542DT-DNA質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。
AGL1 ELECTRO感受態(tài)細胞
操作方法
1.0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高,次使用前*做預實驗確定所加質(zhì)粒的量),用手撥打管底混勻,立即插入冰中,用200μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?蓋上杯蓋,空管保留待用。
3.啟動電轉(zhuǎn)儀,設置參數(shù):C=25μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
注意事項
1.加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
2.混入質(zhì)粒時應輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3.平板上陽性克隆密度過大時,由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質(zhì)粒用量。
4.利福平濃度不應高于25μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50μg/ml kan,若所用平板含有20μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。
5.培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。
應用[4][5]
用于油菜花葉病毒（ORMV）126kDa復制酶基因在擬南芥中的可誘導表達研究
RNA干擾是由雙鏈RNA分子介導的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。植物體內(nèi)的小RNA在植物對抗病毒的RNA干擾機制中起著核心作用,它來自于非蛋白編碼RNA的前體。小RNA通過堿基互補配對原則與靶mRNA結(jié)合起負調(diào)控的作用,利用sRNA抗植物病毒是近年來所研究的一種有效手段。但是病毒為了有效侵染植物,就必須抑制植物體內(nèi)RNAi機制。
因此,植物病毒同時也能夠編碼蛋白在RNAi的不同步驟起到抑制作用,這類蛋白被稱為基因沉默抑制因子。油菜花葉病毒ORMV作為危害油菜等作物生產(chǎn)的病毒之一,屬于煙草花葉病毒屬。ORMV基因結(jié)構(gòu)中的復制酶基因表達的126kDa蛋白是一種基因沉默抑制因子。
126kDa復制酶蛋白在體外（in vitro）可結(jié)合21nt左右的小RNA,油菜花葉病毒的侵染不僅能引起21nt小RNA的積累,還對該類小RNA的底物mRNA的表達產(chǎn)生了影響。為了進一步驗證復制酶蛋白在體內(nèi)（in vivo）對21nt小RNA的結(jié)合富集作用,同時為了更好地了解復制酶蛋白對植物內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本的影響,以及其如何通過影響小RNA進而影響小RNA底物mRNA的表達,我們嘗試在植物中過量表達該蛋白。但是前期的實驗沒有獲得持續(xù)過量地表達該蛋白的植物,這可能是因為過量表達該蛋白對植物有害。
利用植物的可誘導表達技術,在擬南芥中有條件地表達126kDa復制酶蛋白,進而研究ORMV 126kDa復制酶蛋白對植物內(nèi)源小RNA代謝與功能的影響。這些內(nèi)源小RNA與植物對病毒侵染的應答有著緊密聯(lián)系,所以研究這些富集的小RNA類別及作用機制也有助于抗病育種的進一步發(fā)展。Silwet-L77是一種非離子型的表面活性劑,常用于植物的轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn),SilwetL77的加入也可以顯著地提高大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率。
同時,比較了不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)濃度（OD600值）及不同冷凍保護劑對感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的影響。發(fā)現(xiàn),28℃培養(yǎng)E.coli至OD600值為0.55-0.6之間時制備感受態(tài)細胞,利用9%的DMSO做為冷凍保護劑冷凍保存感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化時加入1520ppm的Silwet-L77,可以獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。總之,進一步優(yōu)化了大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法以及轉(zhuǎn)化方法。
參考文獻
[1]Non-Protein-Coding RNAs and their Interacting RNA-Binding Proteins in the Plant Cell Nucleus[J].Celine Charon,Ana Beatriz Moreno,Florian Bardou,Martin Crespi.Molecular Plant.2010(4)
[2]The biosynthetic pathways and biological scopes of plant small RNAs[J].Franck Vazquez,Sylvain Legrand,David Windels.Trends in Plant Science.2010(6)
[3]Criteria for Annotation of Plant MicroRNAs[J].Meyers,Blake C,Axtell,Michael J,Bartel,Bonnie,Bartel,David P,Baulcombe,David,Bowman,John L,Cao,Xiaofeng,Carrington,James C,Chen,Xuemei,Green,Pamela J,Griffiths-Jones,Sam,Jacobsen,Steven E,Mallory,Allison C,Martienssen,Robert A,Poethig,R Scott,Qi,Yijun,Vaucheret,Herve,Voinnet,Olivier,Watanabe,Yuichiro,Weigel,Detlef,Zhu,Jian-Kang.Plant Cell.2008(12)
[4]A single copy of a virus‐derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus[J].Ming‐BoWang,David C.Abbott,Peter M.Waterhouse.Molecular Plant Pathology.2008(6)
[5]黃學娟.油菜花葉病毒（ORMV）126kDa復制酶基因在擬南芥中的可誘導表達[D].聊城大學,2017.