產(chǎn)品規(guī)格
AGL1： 10×50μl
pCAMBIA2301 (control vector) 10ng/μl 10μl
保存條件： -80℃
基因型
C58 RecA (rif r/carbr) Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine
產(chǎn)品說(shuō)明
AGL1菌株為C58, RecA型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif和羧芐青霉素抗性基因carb，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒 pTiBo542DT-DNA，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件， pTiBo542DT-DNA質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。AGL1菌株適用于水稻、擬南芥、楊樹等植物的轉(zhuǎn)基因操作。唯地生物開發(fā)的AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒 (size:11633bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒 (size:40kd)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5 μg質(zhì)粒DNA（質(zhì)粒體積不大于6ul，用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
（當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時(shí)加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。
備注
2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧芐青霉素（carb） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素（kan） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
鏈霉素（strep） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平（rif） | DMSO溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
慶大霉素（gent） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | S | R | S | S |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S |
3、LB及YEB配方：
component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
Agar | － | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | |||
Agar | － | 15 g |
注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。