背景[1-7]
AGL1 Electro感受態(tài)細(xì)胞是以為C58,RecA型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽—利福平抗性基因rif和羧芐青霉素抗性基因carb，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pTiBo542DT-DNA，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pTiBo542DT-DNA質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。
AGL1菌株適用于水稻、擬南芥、楊樹(shù)等植物的轉(zhuǎn)基因操作。唯地生物開(kāi)發(fā)的AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒(size:11633bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒(size:40kd)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×103 cfu/μg DNA。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti(Tumour inducing)質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，并且可以通過(guò)減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。
選擇一種特制的空質(zhì)粒載體（如PBI121質(zhì)粒載體），其上要求含有T-DNA邊界序列（此處可參見(jiàn)詞條雙元表達(dá)載體系統(tǒng)），在序列之間含有復(fù)制原點(diǎn)、抗性基因、GUS報(bào)告基因、HindⅢ和BamH I等酶切位點(diǎn)（以上這些構(gòu)成了一個(gè)T-DNA區(qū)）。先通過(guò)雙酶切反應(yīng)酶切空質(zhì)粒載體和目的基因，再通過(guò)酶連反應(yīng)連接空質(zhì)粒載體和目的基因，從而構(gòu)建成完整的重組質(zhì)粒。
此時(shí)重組質(zhì)粒的T-DNA區(qū)包括T-DNA邊界序列、復(fù)制原點(diǎn)、突變啟動(dòng)子片段、GUS報(bào)告基因、抗性基因。我們稱(chēng)這段T-DNA區(qū)為目的片段。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是構(gòu)建雙元表達(dá)載體系統(tǒng)，由兩種質(zhì)粒組成，一種是位于大腸桿菌中的穿梭質(zhì)粒，另一種是位于農(nóng)桿菌中的輔助性質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中后，用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌去侵染植物根部切口，通過(guò)輔助性質(zhì)粒的Vir區(qū)表達(dá)蛋白與重組質(zhì)粒T-DNA區(qū)（目的片段）的反式作用激活T-DNA的轉(zhuǎn)移（此處可參見(jiàn)詞條雙元表達(dá)載體系統(tǒng)），從而將目的片段整合到植物細(xì)胞基因組中。隨著愈傷組織的形成，使得新生細(xì)胞均含有該目的片段的基因。
應(yīng)用[7][8]
AGL1 Electro感受態(tài)細(xì)胞可用于DNA插入突變及生長(zhǎng)代謝突變子分析的研究：
瑞氏木霉(Trichoderma reesei，anamorph；Hypocrea jecorina)是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)絲狀真菌，可以用于生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多種酶類(lèi)，這些酶類(lèi)已廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、制漿等工業(yè)領(lǐng)域。同時(shí)，由于具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力，該菌已被開(kāi)發(fā)成為表達(dá)同源蛋白和異源蛋白的良好真核宿主。多樣化的代謝能力、對(duì)人沒(méi)有毒性以及生長(zhǎng)快、無(wú)性繁殖等競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)是瑞氏木霉的重要特征。
目前，瑞氏木霉全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，這對(duì)深入了解這個(gè)經(jīng)濟(jì)重要的工業(yè)菌株具有重大意義，同時(shí)也為鑒定那些與該菌生長(zhǎng)、代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因提供了良好平臺(tái)。利用分子標(biāo)簽技術(shù)獲得突變體己成為進(jìn)行基因克隆和遺傳學(xué)分析最有效的方法之一。因此，建立瑞氏木霉基因標(biāo)簽的插入突變體庫(kù)是功能基因組學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)，而對(duì)不同表型突變體的正、反向遺傳學(xué)分析可以促進(jìn)揭示瑞氏木霉生長(zhǎng)、代謝的分子機(jī)理。
研究的目的在于建立和優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，利用T-DNA隨機(jī)插入突變建立瑞氏木霉的突變體庫(kù)；采用反向遺傳學(xué)和正向遺傳學(xué)方法相結(jié)合的策略對(duì)突變株進(jìn)行變異性狀的分析和基因水平的研究，鑒定那些與突變性狀相關(guān)的新基因；選擇那些控制瑞氏木霉生長(zhǎng)、發(fā)育或重要代謝途徑的關(guān)鍵基因發(fā)生插入突變的突變株進(jìn)行生理、生化和分子遺傳學(xué)的研究，深入了解基因的功能和闡明相關(guān)的分子機(jī)理。
1．農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化及T-DNA插入突變分析本文用農(nóng)桿菌AGL1成功介導(dǎo)轉(zhuǎn)化了絲狀真菌瑞氏木霉QM9414，T-DNA隨機(jī)插入到瑞氏木霉染色體中，并得到了一批瑞氏木霉T-DNA插入突變體。將pAN7-1質(zhì)粒的HPH基因表達(dá)盒插入到Ti質(zhì)粒pBI121中，獲得了雙元載體pBI-hph。該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1后，在乙酰丁香酮的誘導(dǎo)下，瑞氏木霉原生質(zhì)體或孢子與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)產(chǎn)生了具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率較高，并篩選到了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
從隨機(jī)挑選的9個(gè)轉(zhuǎn)化子的PCR和雜交分子驗(yàn)證表明，T-DNA上的HPH基因已插入到瑞氏木霉染色體中。借助于TAIL-PCR方法，從轉(zhuǎn)化子中成功克隆到了T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，序列分析證明T-DNA是隨機(jī)插入到瑞氏木霉染色體中的。
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