一、銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱綠膿桿菌，是引起急性或慢性感染的最常見的條件致病菌之一，由其引起的院內感染往往治療難度極大，幾乎具有目前已知的細菌主要耐藥機制，已成為引起院內獲得性肺炎多重耐藥革蘭陰性菌的代表，PA 感染是治療的難題，歸其原因，在于其廣泛而多重的耐藥性[1]。

微生物耐藥機制類型[2]

1、微生物常見的抗生素耐藥機制（下圖）包括：（1）降低細胞膜通透性；（2）水解酶溶菌/滅活藥物；（3）藥物修飾；（4）細胞靶點突變，使抗生素不能有效地與特定靶點結合；（5）通過跨膜外排泵系統(tǒng)主動排出藥物；（6）藥物抑制。

2、主動外排是細菌將有害物質（包括抗生素）排放到細胞外的現(xiàn)象，也是引起MDR的主要方式，這個過程涉及到外排系統(tǒng)對外排底物的識別、固定和輸送。根據(jù)氨基酸序列同源性和底物特異性，一般將這些外排泵分為5大類（下圖）：

1）多藥及毒性化合物外排分子家族（multi-antimicrobial and toxic compound extrusion，MATE）；

2）小多重耐藥轉運分子家族（small multidrug resistance family，SMR）；

3）ATP結合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily，ABC）；

4）主要促進劑超家族（major facilitator superfamily，MFS）；

5）耐藥性結節(jié)化細胞分化分子家族（resistance nodulation division family，RND）。

3、作用機制

1）MATE是由質子勢能和鈉離子濃度梯度共同提供能量將藥物泵出胞外；

2）SMR是轉運蛋白利用質子交換驅動藥物外排，EmrE是其代表成員之一；

3）ABC利用NBD水解ATP為細胞跨膜轉運提供能量；

4）MFS是利用胞內外的質子濃度梯度提供的化學勢能為跨膜轉運供能；

5）RND是外膜蛋白（OMP）與內膜蛋白（IMP）形成轉運通道，二者與周質膜融合蛋白（MFP）相互作用，促使外排泵系統(tǒng)形成穩(wěn)定結構，從而實現(xiàn)藥物外排。

RND泵表現(xiàn)出廣泛的特異性，其三部結構允許將化合物直接從細胞質擠壓到外部環(huán)境。三部結構分別為

膜融合蛋白或連接蛋白（MFP）：MexA、MexC、MexE、以及MexX，

內膜蛋白（IMP）：MexB、MexD、MexF以及MexY，

外膜通道蛋白（OMP）：OprM、OprJ、以及OprN。

其中研究較多的有4種類型：MexAB-OprM 、 MexCD-OprJ 、MexEF-OprN、和MexXY-OprM。

二、替加環(huán)素

替加環(huán)素 (Tigecycline， GAR 936) ，又稱甘氨酞環(huán)素 (glycylcycline)，是繼多西環(huán)素、米諾環(huán)素、美他環(huán)素后開發(fā)的新一代四環(huán)素類抗生素，為個甘氨酰環(huán)類抗菌藥物，為米諾環(huán)素衍生物。通過與核糖體 30 S 亞單位結合、阻止氨?；?tRNA 分子進入核糖體 A 位而抑制細菌蛋白質合成，同時阻止了肽鏈因合并氨基酸殘基而延長。與四環(huán)素相比，在中央的骨架的側鏈上，在第9位以D環(huán)甘氨酰環(huán)代替了 N2烷基2甘氨酰氨基。使抗菌譜更廣，抗菌活性更強，而且使它得以能克服大多數(shù)細菌對四環(huán)素耐藥機制的產生。

替加環(huán)素在體外對大多數(shù)細菌革蘭氏陽性與革蘭氏陰性需氧與厭氧菌，包括金黃色葡萄球菌、腸球菌、肺炎球菌、流感嗜血桿菌、粘膜炎莫拉菌、淋球菌、消化鏈球菌屬、梭狀芽胞桿菌、擬桿菌有很好的抗菌活性。但對銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌無抗菌活性，對吲哚陽性的變形桿菌族與奇異變形桿菌僅能起抑制作用[4-5]。

三、PA對替加環(huán)素的耐藥機制[3]

1、PA對替加環(huán)素的天然抗性，是由MexXY-OprM外排泵介導的

通過研究發(fā)現(xiàn)，在沒有刪除任何基因片段的條件下，銅綠假單胞菌（K767株）對替加環(huán)素的敏感度很差（MIC＞8mg/l）。以往的研究表明，通常情況下，PA通常不會產生MexCD-OprJ 和 MexEF-OprN這兩種外排泵，因此這兩種外排泵不會參與PA的耐藥。而MexAB-OprM在天然情況下會產生，但是通過表2可以得知，被刪除了mexB基因片段了的PA（K1523株）對替加環(huán)素依然耐藥。MexXY基因的表達，需要通過多種抗菌藥物（包括替加環(huán)素）的誘導。刪除mexXY基因后的PA（K1525株），表現(xiàn)除了對替加環(huán)素敏感性的顯著增加，表明MexXY介導的外排泵可顯著性降低PA對替加環(huán)素的敏感性。與mexAB-oprM、mexCD-oprJ和mexEF-oprN不同，mexXY基因座沒有編碼外膜成分的相關基因。一些證據(jù)表明MexAB-OprM外排泵的OprM成分為銅綠假單胞菌的MexXY提供了外膜通道功能。表2顯示，刪除了mexAB-oprM基因的PA（K1119株）與刪除了mexXY基因的PA（K1525株）對替加環(huán)素的有相同的敏感性，而僅有mexB基因丟失的PA（K1523株）對替加環(huán)素的敏感性并沒有明顯增加。因此，強烈表明了oprM與MexXY介導的外排泵與PA的耐藥性有特異性關聯(lián)，有力地支持了oprM與MexXY是共同作用的外膜通道的觀點。

2、替加環(huán)素、四環(huán)素可誘導PA產生Mex X、Mex Y基因

給予不同濃度的替加環(huán)素，發(fā)現(xiàn)在1μg/ml時，mexX、mexY分別有13.43和12.85倍的表達，四環(huán)素在4μg/ml時，也表現(xiàn)出同樣的結果，表明盡管它們兩者的結構不同，但都是mexXY強誘導劑。這也表明四環(huán)素及其衍生物誘導MexXY外排泵的表達是在轉錄水平上介導的。但是，不同濃度都不能使oprM表達增強，表明編碼MexXY-oprM泵外膜通道成分的oprM的轉錄并不是由替加環(huán)素或四環(huán)素誘導的。

3、PA獲得性耐藥

為了測試MexXY的特異性抑制可能有助于將替加環(huán)素的活性擴展到包括銅綠假單胞菌的可能性，將MexXY-oprM完全被抑制的PAO1-MexXY（K1525）、mexB/MexXY（K1542株）和mexAB-oprM（K1119）菌株放在含有4或6μg/ml替加環(huán)素的L-瓊脂平板上，發(fā)現(xiàn)三株菌種很快就產生了對該濃度替加環(huán)素具有抗性的自發(fā)突變體。來自每個親本菌株的兩個代表性突變體（來自mexXY突變體菌株的XY1和XY3，來自mexB/mexXY突變體菌株的BXY1和BXY4，以及來自mexAB oprM突變體菌株的M1和M9）的敏感譜如表2所示。每個突變體對替加環(huán)素的敏感性都降低到了銅綠假單胞菌（野生型）的固有水平，且表現(xiàn)出多藥耐藥表型，表明外排泵參與獲得性耐藥的可能性。也表明即使缺少了MexXY-OprM外排泵，PA也能產生替代性的外排泵以迅速對替加環(huán)素發(fā)生耐藥，說明特異性抑制MexXY不能提高替加環(huán)素對PA敏感性。

4、替加環(huán)素也是MexAB-OprM的作用底物

在缺乏了mexXY基因后，突變菌株XY3對替加環(huán)素的敏感性也降低，研究發(fā)現(xiàn)是出現(xiàn)了過度表達MexAB-OprM，表明替加環(huán)素也是MexAB-OprM的底物。而MexAB-OprM對替加環(huán)素的顯著外排似乎僅在沒有MexXY的情況下發(fā)生，這意味著當兩個泵都存在時，替加環(huán)素優(yōu)先被MexXY-OprM識別。

5、替加環(huán)素也是MexCD-OprJ的作用底物

突變株XY1來源于缺失了mexXY的K1525株，與突變株XY3的不同之處在于它不表現(xiàn)出對羧芐青霉素的耐藥性（表2）。突變體BXY1、BXY4、M1和M9（表2）在耐藥性方面似乎都與XY1屬于同一類，對氯霉素和頭孢吡肟有很高的耐藥性，對羧芐青霉素的敏感性增加，提示存在MexCD-OprJ介導的外排。BXY1和M1對替加環(huán)素的敏感性降低是由MexCD-OprJ介導的，但是MexCD-OprJ在外排替加環(huán)素方面可能不如MexXY-OprM有效。

6、外排甘氨酰環(huán)素

比較多西環(huán)素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、替加環(huán)素以及三種新型甘氨酰環(huán)素對原生型、基因刪除型、突變型PA菌株的敏感譜發(fā)現(xiàn)（表4），缺失了mexAB-oprM的PA菌株（K1119），因缺乏mexAB-oprM和MexXY-oprM外排泵的作用，與比原生型菌株（K767株）相比對四環(huán)素的敏感性增強（MIC均≤0.5 mg/l）。菌株K1525因mexXY基因的特異性缺失，對甘氨酰環(huán)素的敏感性與缺失mexAB-oprM基因菌株（K1119）類似，而對非甘氨酰四環(huán)素（米諾環(huán)素、多西環(huán)素、西環(huán)素）的敏感性則小得多（MIC≥4mg/L）。被刪除了mexXY和mexB基因的菌株（K1542）增加了對非甘氨酰四環(huán)素的敏感性，情況與mexAB-oprM菌株（K1119）相似。因此，米諾環(huán)素和多西霉素主要由MexAB-OprM排出，少量由MexXY-OprM排出。替加環(huán)素、DMG-MINO、DMG-DMDOT和PAM-MINO的外排由MexXY-OprM主要負責，MexAB-OprM在其中的作用似乎較少。

刪除了mexXY基因后的突變菌株XY3，代償性的產生了MexAB-OprM外排泵，導致對米諾環(huán)素和多西環(huán)素的敏感性降低，MIC高達64mg/L，而對甘氨酰環(huán)素的MIC都沒超過8mg/L。類似的情況出現(xiàn)在BXY1和M1菌株，在沒有了MexAB-OprM和MexXY-OprM外排泵的情況下，由于MexCD-OprJ外排泵的作用，對多西環(huán)素、米諾環(huán)素的MIC為128mgL，對甘氨酰環(huán)素的MIC在8-16mg/L。因此，表明，MexCD-OprJ外排泵對甘氨酰環(huán)素的影響較小。

結 論

1、MexXY-OprM外排泵可降低銅綠假單胞菌對替加環(huán)素（和其他甘氨酰環(huán)素）的敏感性。抑制MexXY-OprM活性后，很容易引起MexAB-OprM或MexCD-OprJ或可能的其他外排泵的過度表達，進行代償性外排。與先前四環(huán)素特異性外排泵相比，甘氨酰化四環(huán)素不能克服RND家族泵的外排，且能誘導先天表達的特定泵的發(fā)生相對變化，即從針對半合成四環(huán)素的MexAB-OprM轉變?yōu)獒槍Ω拾滨Ｋ沫h(huán)素的MexXY-OprM。

所以，因銅綠假單胞菌具有高表達MexXY-OprM、MexAB-OprM、MexCD-OprJ外排泵，可將替加環(huán)素外排至細胞外，所以其對替加環(huán)素天然耐藥。

有研究顯示，應用替加環(huán)素后至檢出銅綠假單胞菌的中位時間為 11d，因此需要警惕使用替加環(huán)素繼發(fā)的銅綠假單胞菌感染[4]。

參考資料

[1]鄭璇兒, 楊杰. 銅綠假單胞菌耐藥性的基因學研究進展[J]. 中華實驗和臨床感染病雜志(電子版), 2014, 000(001):111-113.

[2]Armel, Jackson,  Seukep V , et al. Plant-derived secondary metabolites as the main source of efflux pump inhibitors and methods for identification[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2020, v.10(04):5-18.

[3] Dean C R ,  Visalli M A ,  Projan S J , et al. Efflux-mediated resistance to tigecycline (GAR-936) in Pseudomonas aeruginosa PAO1.[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47(3):972-978.

[4]陳子晞, 王弋. 替加環(huán)素治療中銅綠假單胞菌的定植與感染[J]. 醫(yī)藥導報, 2014, 000(007):911-913.

[5]程仕虎, 王睿. 新一代四環(huán)素類藥物替加環(huán)素的研究進展[J]. 科學技術與工程, 2007, 7(16):4123-4130.