背景及概述^[1][2]

(E)-β-金合歡烯可加氫轉(zhuǎn)化為金合歡烷，是一種可再生、可與石化柴油和航天燃料混合使用的燃料。(E)-β-金合歡烯具有不含硫、高十六烷值、低溫性能和低GHG排放的優(yōu)點(diǎn)，是一種應(yīng)用廣泛且效果理想的生物基化學(xué)品。例如，CN101553558A描述了在大腸桿菌中利用含有葡萄糖的培養(yǎng)基通過MEV途徑生成(E)-β-金合歡烯。通過微生物法生產(chǎn)(E)-β-金合歡烯需要解決的一個(gè)重要問題是葡萄糖的來源問題。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50％以上，是一種重要的葡萄糖來源。具體地，纖維素是由D-葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的大分子多糖，不溶于水及一般有機(jī)溶劑，是植物細(xì)胞壁的主要成分。例如，棉花的纖維素含量接近100％。纖維素通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起。例如一般木材中，纖維素占40～50％，還有10～30％的半纖維素和20～30％的木質(zhì)素。

(E)-β-金合歡烯

制備^[2]

步驟1、纖維素酶解液的制備。

稱取粒徑為20～80目的玉米秸稈100g，加入1.5L甲酸溶液(含有88wt％的甲酸和1wt％的HCl)置于處理罐中。在65℃恒溫水浴中反應(yīng)3h后將反應(yīng)漿液固液分離。對(duì)固體組分再進(jìn)行氨水處理，處理?xiàng)l件為：氨水濃度15wt％、每千克固體組分所用的氨水的體積為8升、處理溫度60℃和反應(yīng)時(shí)間16h。反應(yīng)結(jié)束后將物料固液分離，固體組分用蒸餾水洗滌至pH6～7，烘干，得到預(yù)處理后的固態(tài)物料。

將所述預(yù)處理后的固態(tài)物料進(jìn)行酶促水解，酶解條件包括：溫度為50℃、每千克預(yù)處理后的固態(tài)物料所用緩沖液的體積為20升、緩沖液為pH為4.8的檸檬酸緩沖液(0.15mol/L)、酶促水解所用的酶為纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，所述纖維素酶加酶量為每克預(yù)處理后的固態(tài)物料30U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量為每克預(yù)處理后的固態(tài)物料60U。酶解24h后將反應(yīng)漿液取出，在沸水浴中滅酶10min后進(jìn)行抽濾。抽濾所得液體組分利用HPLC分析檢測(cè)，所得纖維素酶解液葡萄糖濃度為38.2g/L。

步驟2、質(zhì)粒的序列結(jié)構(gòu)。

按照上述載體的使用說明書采用PCR克隆、全基因合成、限制性內(nèi)切酶酶切和連接等分子生物學(xué)操作，首先構(gòu)建1套MEP代謝路徑的質(zhì)粒，具體包括pDCDE質(zhì)粒、pFGHII質(zhì)粒和pFG質(zhì)粒，接著構(gòu)建1套MVA代謝路徑的質(zhì)粒，具體包括pMevT質(zhì)粒、pMBIS質(zhì)粒和pFG質(zhì)粒，再構(gòu)建1個(gè)用于替換pFG質(zhì)粒且插入有Hfq基因的質(zhì)粒，即pFGH質(zhì)粒。

步驟3、工程菌株的構(gòu)建過程。

實(shí)驗(yàn)組工程菌株F1的構(gòu)建：選用大腸桿菌BL21為宿主細(xì)胞，通過CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pDCDE、pFGHII和pFGH。該菌株通過可通過MEP代謝路徑合成(E)-β-金合歡烯，同時(shí)具有Hfq蛋白的過表達(dá)。在抗生素抗性篩選平板上，選取該菌株的3個(gè)克隆，分別為F1-1、F1-2和F1-3。

實(shí)驗(yàn)組工程菌株F2的構(gòu)建：選用大腸桿菌BL21為宿主細(xì)胞，通過CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pMevT、pMBIS和pFGH。該菌株通過可通過MVA代謝路徑合成(E)-β-金合歡烯，同時(shí)具有Hfq蛋白的過表達(dá)。在抗生素抗性篩選平板上，選取該菌株的3個(gè)克隆，分別為F2-1、F2-2和F2-3。

對(duì)照組工程菌株DF1的構(gòu)建：選用大腸桿菌BL21為宿主細(xì)胞，通過CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pDCDE、pFGHII和pFG。該菌株通過可通過MEP代謝路徑合成(E)-β-金合歡烯，但沒有Hfq蛋白的過表達(dá)。在抗生素抗性篩選平板上，選取該菌株的3個(gè)克隆，分別為DF1-1、DF1-2和DF1-3。

對(duì)照組工程菌株DF2的構(gòu)建：選用大腸桿菌BL21為宿主細(xì)胞，通過CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pMevT、pMBIS和pFG。該菌株通過可通過MVA代謝路徑合成(E)-β-金合歡烯，但沒有Hfq蛋白的過表達(dá)。在抗生素抗性篩選平板上，選取該菌株的3個(gè)克隆，分別為DF1-1、DF1-2和DF1-3。

步驟4、利用纖維素制備(E)-β-金合歡烯的方法。

將步驟1得到的纖維素酶解液作為含有單糖的水解產(chǎn)物，用于制備液態(tài)發(fā)酵原料。每升所述液態(tài)發(fā)酵原料含有100mL實(shí)施例1得到的纖維素酶解液以及10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl和余量的水。液態(tài)發(fā)酵原料滅菌后待用。

在上述液態(tài)發(fā)酵原料中添加抗生素(氯霉素、卡那霉素和氨芐青霉素，終濃度為30mg/L)，然后分別接種步驟3得到的12個(gè)克隆，接種密度為200×107個(gè)/L。在37℃下培養(yǎng)至OD600在0.6～08之間，向發(fā)酵液中添加終濃度為200mg/L的IPTG、終濃度為1g/L的L-阿拉伯糖和20mL正癸烷，在30℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以發(fā)酵合成(E)-β-金合歡烯。誘導(dǎo)24h后取1mL發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞密度和(E)-β-金合歡烯濃度的檢測(cè)。

主要參考資料

[1] 雷林潔, 滕亮, 趙欣, 于富生, & 王長虹. (2013). 多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝及化學(xué)成分研究. 中成藥, 35(006), 1251-1256.

[2] 彭小冰, 邵進(jìn)明, 劉炳新, 張豐, 靳鳳云, & 吳家紅. (2014). 葎草鮮品不同部位的揮發(fā)油成分及含量. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 42(004), 178-181.

[3] 高嵐, 李寶石, 齊崴, 陶志平, 尤生萍, & 李妍等. (2020). 利用纖維素制備金合歡烯的工程菌株及方法.  CN110964680A.