背景[1-3]
小鼠肺泡上皮細胞MLE-12為HPV16E6、E7和ras基因共轉(zhuǎn)化的C57BL/C(H-2b)小鼠肺上皮細胞，分離自小鼠肺泡上皮組織。
小鼠肺泡上皮細胞 MLE-12
細胞培養(yǎng)步驟：
培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
傳代方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
應用[4][5]
用于乙酰化修飾JAK2/STAT3對AngⅡ誘導小鼠肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化影響的機制研究
研究JAK2/STAT3信號通路對AngⅡ誘導小鼠肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響。
方法：（1）復制小鼠肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化模型,依次用濃度為0.1umol/l、lumol/l、10umol/l的AngⅡ干預貼壁生長的MLE-12細胞,48h后收集蛋白,Western blot檢測α-SMA表達,明確AngⅡ的干預濃度。
（2）將體外培養(yǎng)MLE-12細胞分為正常對照組、DMSO對照組、AngⅡ刺激組、AngⅡ+AG490組,正常對照組給予10ul PBS,DMSO對照組給予10umol/LDMSO+lumol/LAngⅡ,AngⅡ刺激組給予1 umol/L AngⅡ,AngⅡ+AG490組給予1 Oumol/L AG490+1umol/L AngⅡ,干預30min后收集蛋白,采用Western blot檢測信號通路蛋白：JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）的表達水平。
（3）分組干預48h后收集蛋白,檢測上皮細胞的標記物E-鈣黏素（E-cadherin）,間質(zhì)細胞的標記物平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及促纖維化因子TGF-β的表達,通過上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的標記物,評估JAK2/STAT3信號通路在參與AngⅡ誘導小鼠肺泡上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中的作用。
（4）分組干預48h后,用CCK8法檢測不同干預藥物對MLE-12細胞活性的影響。
結(jié)果：（1）不同濃度AngⅡ?qū)LE-12細胞表達α-SMA的影響。與空白對照組相比,lumol/1 AngⅡ干預48h后MLE-12細胞表達的α-SMA顯著增加（P<0.05）,繼續(xù)增加AngⅡ干預濃度,MLE-12細胞表達的α-SMA未進一步增加,故本研究中采用lumol/l AngⅡ干預MLE-12細胞48h來復制肺泡上皮轉(zhuǎn)分化模型。
（2）AngⅡ上調(diào)MLE-12細胞中JAK2/STAT3信號通路蛋白的表達。正常體外培養(yǎng)的MLE-12較少表達p-JAK2、p-STAT3,加入AngⅡ誘導30min后JAK2、STAT3無明顯變化,而反應信號通路活化狀態(tài)的p-JAK2、p-STAT3水平則明顯升高（P<0.01）。
參考文獻
[1]Role of the JAK/STAT signaling pathway in diabetic nephropathy.Marrero Mario B,Banes-Berceli Amy K,Stern David M,Eaton Douglas C.American journal of physiology.Renal physiology.2006
[2]STAT-1 Signaling in Human Lung Fibroblasts Is Induced by Vanadium Pentoxide through an IFN-βAutocrine Loop.Aurita Antao-Menezes,Elizabeth A.Turpin,Phillip C.Bost,Jessica P.Ryman-Rasmussen,James C.Bonn.J.Immunol.2008
[3]Quality of Life,Pulmonary Function,and Tomographic Scan Abnormalities After ARDS.Joan R.Masclans,Oriol Roca,Xavier Munoz.Chest.2011
[4]Stat3 Dimerization Regulated by Reversible Acetylation of a Single Lysine Residue.Zheng-long Yuan,Ying-jie Guan,Devasis Chatterjee,Y.Eugene Ch.Science.2005
[5]盧森.乙?；揎桱AK2/STAT3對AngⅡ誘導小鼠肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化影響的機制研究[D].東南大學,2015.