背景^[1-3]

小鼠肺泡上皮細(xì)胞MLE-12為HPV16E6、E7和ras基因共轉(zhuǎn)化的C57BL/C(H-2b)小鼠肺上皮細(xì)胞，分離自小鼠肺泡上皮組織。

小鼠肺泡上皮細(xì)胞 MLE-12

細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

傳代方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于乙?；揎桱AK2/STAT3對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化影響的機(jī)制研究

研究JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響。

方法：（1）復(fù)制小鼠肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化模型,依次用濃度為0.1umol/l、lumol/l、10umol/l的AngⅡ干預(yù)貼壁生長(zhǎng)的MLE-12細(xì)胞,48h后收集蛋白,Western blot檢測(cè)α-SMA表達(dá),明確AngⅡ的干預(yù)濃度。

（2）將體外培養(yǎng)MLE-12細(xì)胞分為正常對(duì)照組、DMSO對(duì)照組、AngⅡ刺激組、AngⅡ+AG490組,正常對(duì)照組給予10ul PBS,DMSO對(duì)照組給予10umol/LDMSO+lumol/LAngⅡ,AngⅡ刺激組給予1 umol/L AngⅡ,AngⅡ+AG490組給予1 Oumol/L AG490+1umol/L AngⅡ,干預(yù)30min后收集蛋白,采用Western blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白：JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）的表達(dá)水平。

（3）分組干預(yù)48h后收集蛋白,檢測(cè)上皮細(xì)胞的標(biāo)記物E-鈣黏素（E-cadherin）,間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及促纖維化因子TGF-β的表達(dá),通過(guò)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的標(biāo)記物,評(píng)估JAK2/STAT3信號(hào)通路在參與AngⅡ誘導(dǎo)小鼠肺泡上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的作用。

（4）分組干預(yù)48h后,用CCK8法檢測(cè)不同干預(yù)藥物對(duì)MLE-12細(xì)胞活性的影響。

結(jié)果：（1）不同濃度AngⅡ?qū)LE-12細(xì)胞表達(dá)α-SMA的影響。與空白對(duì)照組相比,lumol/1 AngⅡ干預(yù)48h后MLE-12細(xì)胞表達(dá)的α-SMA顯著增加（P<0.05）,繼續(xù)增加AngⅡ干預(yù)濃度,MLE-12細(xì)胞表達(dá)的α-SMA未進(jìn)一步增加,故本研究中采用lumol/l AngⅡ干預(yù)MLE-12細(xì)胞48h來(lái)復(fù)制肺泡上皮轉(zhuǎn)分化模型。

（2）AngⅡ上調(diào)MLE-12細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。正常體外培養(yǎng)的MLE-12較少表達(dá)p-JAK2、p-STAT3,加入AngⅡ誘導(dǎo)30min后JAK2、STAT3無(wú)明顯變化,而反應(yīng)信號(hào)通路活化狀態(tài)的p-JAK2、p-STAT3水平則明顯升高（P<0.01）。

參考文獻(xiàn)

[1]Role of the JAK/STAT signaling pathway in diabetic nephropathy.Marrero Mario B,Banes-Berceli Amy K,Stern David M,Eaton Douglas C.American journal of physiology.Renal physiology.2006

[2]STAT-1 Signaling in Human Lung Fibroblasts Is Induced by Vanadium Pentoxide through an IFN-βAutocrine Loop.Aurita Antao-Menezes,Elizabeth A.Turpin,Phillip C.Bost,Jessica P.Ryman-Rasmussen,James C.Bonn.J.Immunol.2008

[3]Quality of Life,Pulmonary Function,and Tomographic Scan Abnormalities After ARDS.Joan R.Masclans,Oriol Roca,Xavier Munoz.Chest.2011

[4]Stat3 Dimerization Regulated by Reversible Acetylation of a Single Lysine Residue.Zheng-long Yuan,Ying-jie Guan,Devasis Chatterjee,Y.Eugene Ch.Science.2005

[5]盧森.乙?；揎桱AK2/STAT3對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化影響的機(jī)制研究[D].東南大學(xué),2015.