背景^[1-3]

SDS細(xì)胞裂解液是一種比較強(qiáng)烈的細(xì)胞組織裂解液，通過陰離子去垢劑SDS促進(jìn)細(xì)胞膜的崩解，特別適用于膜蛋白或者細(xì)胞骨架蛋白等難溶蛋白的溶解，有利于膜蛋白，胞漿蛋白、核蛋白、胞漿磷酸化蛋白及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的提取。

SDS細(xì)胞裂解液具有有強(qiáng)烈的蛋白變性作用，不能用于非變性蛋白方面的研究。本產(chǎn)品裂解得到的蛋白樣品可用于常規(guī)的Western、染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)等。

蛋白檢測(cè)膠圖

使用方法：

1.對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品

(1)融解SDS細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。

(2)細(xì)胞裂解

對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150~250μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1~2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解10 min。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150~250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50~100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解10分鐘。

(3)充分裂解后，10000~14000rpm離心3~5 min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和ChIP等操作。

2.對(duì)于組織樣品：

(1)把組織剪切成細(xì)小的碎片。

(2)融解SDS細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

(3)按照每20毫克組織加入150—250μL裂解液的比例加入裂解液，如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。具體SDS細(xì)胞裂解液的用量參照表1。

(4)用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解10分鐘。

(5)充分裂解后，10000~14000 rpm離心3~5 min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和ChIP等操作。

應(yīng)用^[4][5]

用于組蛋白變異體H2A.X在卵母細(xì)胞裂解液逆轉(zhuǎn)化小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（MEFs）成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）中的作用研究

過體外獲取小鼠卵母細(xì)胞,制備卵母細(xì)胞裂解液,利用其中含有的重編程因子,將不同濃度的卵母細(xì)胞裂解液（20個(gè)/20μl、30個(gè)/20μl、40個(gè)/20μl、50個(gè)/20μl和60個(gè)/20μl）與經(jīng)過適宜濃度鏈球菌溶血素O（streptolysin O,SLO）（25U）滲透化處理的第三代MEFs共孵育,以研究不同濃度的卵母細(xì)胞裂解液對(duì)MEFs重編程的影響。然后,通過在卵母細(xì)胞裂解液重編程中添加單一的表觀遺傳修飾因子TSA或5-Aza-dC和同時(shí)添加TSA、5-Aza-dC兩種因子,觀察不同處理之間重編程效率的差異,旨在優(yōu)化卵母細(xì)胞裂解液重編程體細(xì)胞的體系,提高重編程效率,減少重編程時(shí)間。

結(jié)果表明:當(dāng)卵母細(xì)胞裂解液濃度為40個(gè)/20μl、50個(gè)/20μl和60個(gè)/20μl時(shí),iPSCs的集落數(shù)（分別為24±1.25個(gè)、23.88±0.47個(gè)和22±1.63個(gè)）極顯著高于20個(gè)/20μl和30個(gè)/20μl處理組的集落數(shù)（分別為11.33±1.7個(gè)和17±0.82個(gè)）（P<0.01）,而卵母細(xì)胞裂解液濃度為40個(gè)/20μl、50個(gè)/20μl以及60個(gè)/20μl時(shí)所形成的ipscs集落數(shù)差異不顯著（p>0.05）;當(dāng)在卵母細(xì)胞裂解液重編程基礎(chǔ)上同時(shí)添加了tsa和5-aza-dc時(shí),ipscs集落數(shù)（35.88±0.77個(gè)）顯著高于只添加一種表觀遺傳修飾因子tsa或5-aza-dc的集落數(shù)（分別為29±1.45個(gè)、30±0.98個(gè)）（p<0.05）。

因此,在卵母細(xì)胞裂解液濃度為40個(gè)/20μl、50個(gè)/20μl和60個(gè)/20μl重編程效率差異不大的情況下,宜采用40個(gè)/20μl卵母細(xì)胞裂解液重編程mefs,同時(shí),為了提高重編程效率,縮短時(shí)間,添加表觀遺傳修飾因子tsa和5-aza-dc能更大程度的提高卵母細(xì)胞裂解液重編程的效率。

參考文獻(xiàn)

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[2]Histone Variant H2A.Bbd Is Associated with Active Transcription and mRNA Processing in Human Cells[J].Michael Y.Tolstorukov,Joseph A.Goldman,Cristele Gilbert,Vasily Ogryzko,Robert E.Kingston,Peter J.Park.Molecular Cell.2012(4)

[3]Histone tyrosine phosphorylation comes of age[J].Rakesh Kumar Singh,Akash Gunjan.Epigenetics.2011(2)

[4]Stepwise Histone Replacement by SWR1 Requires Dual Activation with Histone H2A.Z and Canonical Nucleosome[J].Ed Luk,Anand Ranjan,Peter C.FitzGerald,Gaku Mizuguchi,Yingzi Huang,Debbie Wei,Carl Wu.Cell.2010(5)

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