背景及概述[1]
睪酮是一種類固醇荷爾蒙，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺亦分泌少量；但絕經(jīng)后婦女，卵巢分泌睪酮顯著減少。在男性中，它對(duì)外生殖器和第二性征的發(fā)育起著重要作用，其生物化學(xué)過(guò)程尚未完全闡明。女性中，其主要作用是作為一種雌激素的前體。同時(shí)，睪酮可能影響許多身體系統(tǒng)和功能，包括：血生成，體內(nèi)鈣平衡，骨礦化作用，脂代謝，糖代謝和前列腺增長(zhǎng)。
大多數(shù)睪酮與性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)結(jié)合，在男性中也被稱為睪丸激素結(jié)合球蛋白；少數(shù)與白蛋白結(jié)合，一小部分以游離形式存在。游離睪酮被認(rèn)為是生物活性成分。然而，睪酮與白蛋白結(jié)合較弱，所以所有非SHBG結(jié)合的睪酮被認(rèn)為是生物可利用的。
在兒童期，過(guò)多睪酮會(huì)誘發(fā)男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，過(guò)量的睪酮會(huì)造成不同程度的男性化，包括多毛，痤瘡，月經(jīng)稀發(fā)，或不育。睪酮輕度至中度升高對(duì)男性通常無(wú)明顯癥狀，但對(duì)女性造成嚴(yán)重的影響。對(duì)于睪酮輕度至中度升高的確切原因往往不清楚。明顯升高的常見(jiàn)原因包括遺傳疾病(如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥)，腎上腺，睪丸和卵巢的腫瘤和運(yùn)動(dòng)員濫用睪丸激素或促性腺激素通。女性的睪酮降低會(huì)引起微妙的癥狀，這主要包括性欲下降和非特異性的情緒變化。在男性，它會(huì)導(dǎo)致性腺功能減退，這個(gè)特點(diǎn)將改變男性的第二性征和生育功能。
制備[2-3]
報(bào)道一、
步：將30g雄烯二酮溶解于10倍重量的混合溶劑中(二氯甲烷∶四氫呋喃＝1∶ 1)，冷卻到-15℃。
第二步：將3g硼氫化鉀溶解在30ml蒸餾水或純水中。
第三步：用蠕動(dòng)泵將第二步得到的硼氫化鉀的水溶液加到步獲得的、-8℃的 反應(yīng)體系中，流速0.2ml/min。
第四步：加畢，在-5℃至-10℃反應(yīng)至雄烯二酮反應(yīng)完全(HPLC跟蹤)，加入1g冰乙 酸破壞過(guò)量的硼氫化鉀，旋蒸回收溶劑，加入450ml蒸餾水，冷卻到10℃，過(guò)濾，水洗，真空干 燥，得粗品。
第五步：用10倍重量的無(wú)水乙醇溶解粗品，加入5wt％的活性炭脫色，趁熱過(guò)濾，減 壓濃縮出85wt％的乙醇，冷凍，結(jié)晶，過(guò)濾，冷凍的無(wú)水乙醇洗滌，80℃真空干燥，得白色結(jié) 晶。質(zhì)量經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果如下：
熔點(diǎn)：153-156℃(文獻(xiàn)值：152-156℃)；含量98.5％(w/w)(HPLC法)；質(zhì)譜：289[M- H]+；核磁共振1HNMR(CDCl3)0.79(s，3H，CH3)，1.12(s，3H.CH3)，3.66(t，1H)，5.72(s，H， CH)；紅外譜圖IR(KBr，v/cm-1)：3529，3381，3027，2943，2873，2847，1656，1610，1056。
經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)品是睪酮。副產(chǎn)3，17-二醇物含量0.45％(w/w)，睪酮收率達(dá)到了93％ (w/w)以上。
報(bào)道二、
步驟1：重組Y.lipolytica Polh菌株的構(gòu)建
以實(shí)驗(yàn)室全合成的基因?yàn)槟０?，利用PCR手段獲得該酶的基因，連接克隆載體，實(shí)現(xiàn)基 因的大量擴(kuò)增。將大量擴(kuò)增的17β-hsd3和gdh基因片段，純化后分別連接到pINA1292和 pYLSC載體上，驗(yàn)證成功后，轉(zhuǎn)化模式菌株Y.lipolytica Polh。在抗性平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子， 接種搖瓶發(fā)酵，用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中產(chǎn)物TS。檢測(cè)到有產(chǎn)物TS，說(shuō)明構(gòu)建成功了具有轉(zhuǎn) 化AD為T(mén)S的重組菌株。本發(fā)明最終得到具有高效轉(zhuǎn)化AD為T(mén)S的Y.lipolytica Polh菌株。
步驟2：重組菌株的酶活力測(cè)定
酶活測(cè)定方法：采用HPLC方法測(cè)定。具體方法如下：取培養(yǎng)24h的菌液50mL,4℃， 8,000r/min離心5min收集菌體，用50mL pH 7.0的Tris-HCl緩沖液洗滌兩次，重懸于5ml 的該緩沖液中。冰浴中40％功率超聲破碎，工作2s間歇5s，工作時(shí)間10min。10,000r/min 離心30min獲得上清液，上清液中即為目的蛋白。酶活測(cè)定方法如下：酶活測(cè)定體系1mL 包括0.5mM NADPH,200μM AD(溶于甲醇)，再加入適量酶液。酶活力單位定義：37℃溫 度下，1min轉(zhuǎn)化1μmol AD生成TS的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。葡萄糖脫氫酶活力 測(cè)定方法：1mL反應(yīng)體系包括50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)，10mM葡萄糖和1μM NADP+。 根據(jù)在340nm下NADPH吸光值的變化測(cè)定活力，酶活單位定義：每分鐘產(chǎn)生1μmol NADPH 所需要的酶量。酶活分別達(dá)到7.35U/mg和4.23U/mg。
步驟3：重組菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化性能檢測(cè)
將該菌株以5％接種量接種于100mL BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，然后以5％接種量接 種于裝有2L BMMY培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，持續(xù)添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)4天。離心回收菌體， 洗滌兩次，用一定量的50mM的Tris-HCl pH 7.5緩沖液復(fù)溶,加入底物AD進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化 條件為：轉(zhuǎn)化溫度為37℃，轉(zhuǎn)化pH為7.5，底物助溶劑為甲基化-β-環(huán)糊精(摩爾比例為1:1)， 生物量為200g/L，底物濃度為5g/L。經(jīng)過(guò)3次補(bǔ)料全細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，15g/L雄甾烯二酮轉(zhuǎn)化 為14.3g/L睪酮，為國(guó)內(nèi)外首次通過(guò)構(gòu)建NADPH輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)在畢赤酵母中利用雄甾 烯二酮轉(zhuǎn)化生產(chǎn)睪酮，最終實(shí)現(xiàn)提高轉(zhuǎn)化速率、高效生產(chǎn)睪酮的目的。
參考文獻(xiàn)
[1][中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)]CN201410484568.5一種檢測(cè)人血清中總睪酮的方法
[2] [中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)] CN201610435623.0 一種合成睪酮方法
[3] [中國(guó)發(fā)明] CN201610575007.5 一種微生物法轉(zhuǎn)化雄甾烯二酮生產(chǎn)睪酮的方法