背景^[1-3]

人角膜上皮細(xì)胞分離自眼角膜組織；角膜系眼球外膜呈半球形向前突出的部分。占外膜的1/6，橫為橢圓形，約11.5～12mm，垂直徑約10.5～11mm，厚約1mm，中央部稍Chemicalbook薄約0.8mm；前面曲率半徑均值為7.8mm，后面為6.8mm。角膜由致密結(jié)締組織組成，可分為5層，即上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層及內(nèi)皮細(xì)胞層。

角膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)對研究角膜的生理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)都是極為重要的手段，常用于研究細(xì)胞代謝產(chǎn)物、病毒感染、各種生長因子和藥物對細(xì)胞生長的影響。

人角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)：

1.將供體角膜放于消毒過的容器上，上皮面朝上，用手術(shù)刀切成12個三角形組織片。應(yīng)一刀切下，避免鋸割。如此仔細(xì)處理角膜可減少對膠原基質(zhì)的破壞和成纖維細(xì)胞的脫落。

2.將角膜組織片的上皮面朝向下，放入用鼠尾Ⅰ型膠原蛋白預(yù)處理的6孔培養(yǎng)板，每孔放4個組織塊。

3.用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養(yǎng)皿表面充分接觸。將組織片放置20min，使其變干。

4.將一滴KGM輕輕滴于組織片上，在37℃和5%CO2條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用抗菌素的培養(yǎng)液保存的，但全部操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。

5.第2d，在培養(yǎng)皿中加入1ml培養(yǎng)液。在培養(yǎng)早期，可觀察到細(xì)胞僅從角膜緣處遷出，但沒有細(xì)胞從角膜或虹膜遷出。無血清培養(yǎng)液含有低濃度鈣離子（0.15mmol/L），減少膠原基質(zhì)降解，故這種培養(yǎng)液可減少成纖維細(xì)胞長出。

6.在植入角膜組織片后第5d，用鑷子將組織片取出，再加入3ml培養(yǎng)液。取出組織片后，貼壁細(xì)胞繼續(xù)增值。第2周，細(xì)胞生長形成單層，呈現(xiàn)上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個角膜約獲得6×106個上皮細(xì)胞。每周換液2次。

7.擴(kuò)增培養(yǎng)：取出組織片后，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%-80%時，用PBS浸洗細(xì)胞。然后，在37℃條件下用胰蛋白酶-EDTA液處理4min。用含有10%FBS的PBS終止消化。將細(xì)胞離心后，用KGM混懸。計數(shù)細(xì)胞，以1×104個/cm2密度將細(xì)胞接種于涂有FNC的培養(yǎng)皿。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。1d后換培養(yǎng)液。

應(yīng)用^[4][5]

用于IL-1β誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的分子機制及地塞米松對其抑制作用的研究

IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8的分子機制,主要以三條經(jīng)典的MAPKs信號通路,即ERK,p38和JNK信號通路,以及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB為分子靶點,研究其在IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8中的作用以及IL-1β活化的三條MAPKs信號通路與IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB亞基p65入核和IL-1β上調(diào)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性之間的內(nèi)在聯(lián)系。

方法：通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）技術(shù)檢測給予和不給予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平,以及抑制三條MAPKs信號通路和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB后,再給予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平。

采用Western blot技術(shù)檢測給予和不給予IL-1β刺激的三條經(jīng)典的MAPKs信號通路及NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平。通過細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)檢測給予和不給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB亞基p65的亞細(xì)胞定位以及分別單獨抑制三條MAPKs信號通路后再給予IL-1β刺激的HCECs p65的亞細(xì)胞定位；行雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)檢測給予和不給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及分別單獨抑制三條MAPKs信號通路后再給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。

參考文獻(xiàn)

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[3]LPS-and LTA-Induced Expression of IL-6 and TNF-αin Neonatal and Adult Blood:Role of MAPKs and NF-κB[J].Lutz Koch,David Frommhold,Kirsten Buschmann,Navina Kuss,Johannes Poeschl,Peter Ruef,Fulvio D’Acquisto.Mediators of Inflammation.2014

[4]IL-1βUpregulates IL-8 Production in Human Müller Cells Through Activation of the p38 MAPK and ERK1/2 Signaling Pathways[J].Xiufen Liu,Fei Ye,Huabao Xiong,Danning Hu,G.Astrid Limb,Tian Xie,Liang Peng,Wei Yang,Yabin Sun,Mingming Zhou,E Song,David Y.Zhang.Inflammation.2014(5)

[5]周衛(wèi)萍.IL-1β誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的分子機制及地塞米松對其抑制作用的研究[D].浙江大學(xué),2015.