背景^[1-3]

腎小管上皮細(xì)胞是指腎小管的外面的一層細(xì)胞，是研究腎臟疾病的一項(xiàng)重要材料，該細(xì)胞分離方法有酶分離法、化學(xué)分離法篩網(wǎng)分離法、顯微解剖分離法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫分離法。

腎小管上皮細(xì)胞的主要作用是重新吸收。血液經(jīng)過(guò)腎小球，在腎小球內(nèi)濾出到腎小囊內(nèi)的為原尿，里面含有水，葡萄糖，氨基酸，尿酸，尿素和電解質(zhì)。但是在終尿中，并不含有氨基酸和葡萄糖，是因?yàn)樵蚪?jīng)過(guò)腎小管，被腎小管上皮細(xì)胞重新吸收，原尿中99%的水，全部的葡萄糖和氨基酸，部分電解質(zhì)被重新吸收，尿素也被部分重新吸收，而肌酐則不被吸收。由此完成了一個(gè)重新吸收的作用。

腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)

1．取材：取腎小管上皮，切成0.5～1平方厘米小塊。

2．EDTA處理：先置入0.02%EDTA中室溫置5分鐘。

3．冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中，置4℃過(guò)夜。

4．分離：取出皮膚，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)。

5．溫消化：取出表皮單獨(dú)處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25%胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分鐘。

6．用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液。

7．培養(yǎng)液：通過(guò)80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和20%小牛血清，制成細(xì)胞懸液，接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于自噬對(duì)鎘致大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制研究

腎臟是鎘毒性作用的靶器官,國(guó)內(nèi)外學(xué)者從環(huán)境污染、職業(yè)性暴露和動(dòng)物試驗(yàn)等多等方面對(duì)鎘所致腎毒性機(jī)理進(jìn)行了廣泛、深入地研究;但這些研究多集中于凋亡機(jī)理的探究,而對(duì)鎘所致腎臟毒性過(guò)程中自噬的機(jī)理、作用及其與凋亡關(guān)系的探究較少。

1. 鎘誘導(dǎo)大鼠腎臟皮質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬分為體外和體內(nèi)兩部分。體外試驗(yàn)采用機(jī)械篩網(wǎng)結(jié)合酶消化法建立原代大鼠腎小管上皮細(xì)胞（rPT cells）培養(yǎng)模型,在傳一代細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)時(shí)間進(jìn)行鎘染毒處理,同時(shí)選擇NRK-52E細(xì)胞株進(jìn)行同樣處理。

2. CCK-8法測(cè)定不同濃度的鎘在不同染毒時(shí)間對(duì)rPT細(xì)胞和NRK-52E細(xì)胞活性的影響;MDC熒光探針?lè)z測(cè)不同濃度的鎘在不同染毒時(shí)間對(duì)rPT細(xì)胞和NRK-52E細(xì)胞自噬水平的影響;2.5μ和5μM鎘處理rPT細(xì)胞、5⒚M和10μM鎘處理NRK-52E細(xì)胞6 h,免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、p62和Beclin-1表達(dá)水平變化。

結(jié)果表明,2.5μM和5μM鎘處理rPT細(xì)胞、5μM和10μ鎘處理NRK-52E細(xì)胞6h,細(xì)胞活性最強(qiáng),自噬水平最高,極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）;2.5μM和5μM鎘處理rPT細(xì)胞、5μM和10μM鎘處理NRK-52E細(xì)胞12h,細(xì)胞自噬水平最低,極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。

體內(nèi)試驗(yàn)選擇SD大鼠32只,隨機(jī)分為4組:對(duì)照組（DDW）和鎘組（CdAc2,50mg/kg·bw）,飼養(yǎng)1周;對(duì)照組（DDW）和鎘組（CdAc2,50mg/kg·bw）,飼養(yǎng)8周。取腎臟皮質(zhì),RT-PCR法檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3、p62和Beclin-1表達(dá)量變化;免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、p62和Beclin-1表達(dá)水平變化。

結(jié)果表明,鎘染毒處理1周后,大鼠腎臟皮質(zhì)自噬水平極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）;與對(duì)照組相比Beclin-1表達(dá)水平極顯著升高（P<0.01）。

參考文獻(xiàn)

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