背景[1-3]
CT-26細(xì)胞是以N-nitroso-N-methylurethane-(NNMU)誘導(dǎo)形成的未分化結(jié)腸癌細(xì)胞株。它克隆形成的細(xì)胞株命名為CT26.WT(ATCC CRL-2638)。用包含編碼典型腫瘤相關(guān)抗原(TAA)beta-半乳糖苷酶(beta-gal)的lacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CT26。即使CT26.CL25表達(dá)了典型的TAA beta-半乳糖苷酶，在正常小鼠中CT26.CL25和CT26.WT的生長率與致死率也保持基本一致。與CT26.CL25(ATCC CRL-2639)一起可用作測試免疫治療程序的模型，并用于研究宿主免疫反應(yīng)。
培養(yǎng)步驟：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
傳代方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
應(yīng)用[4][5]
用于胡桃醌及胡桃醌與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的體內(nèi)作用研究
建立小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞移植瘤模型,按體重隨機(jī)分為6組:模型組、陽性藥組（20.0mg/kg 5-氟尿嘧啶）、胡桃醌低劑量組（2.5mg/kg胡桃醌）、胡桃醌高劑量組（5.0mg/kg胡桃醌）、聯(lián)合給藥低劑量組（5.0mg/kg胡桃醌+10.0mg/kg 5-氟尿嘧啶）、聯(lián)合給藥高劑量組（5.0mg/kg胡桃醌+20.0mg/kg 5-氟尿嘧啶）。
連續(xù)給藥9天后,進(jìn)行動物處理和樣本采集。檢測指標(biāo)包括:瘤重及腫瘤HE染色形態(tài)學(xué)觀察、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù),血清中白介素-2、血管內(nèi)皮生長因子、干擾素-γ含量,免疫組化檢測ki-67蛋白、E-鈣粘蛋白、突變型P53蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)量。胡桃醌高和胡桃醌低劑量組抑瘤率分別為40.38%和31.73%,聯(lián)合高和聯(lián)合低劑量組抑瘤率分別為75.01%,高于胡桃醌單獨(dú)應(yīng)用組及陽性藥組,說明胡桃醌具有非常明確的體內(nèi)抗結(jié)腸癌作用,且胡桃醌能增強(qiáng)5-FU抗結(jié)腸癌效果。胡桃醌能明顯提高血清中白介素-2、干擾素-γ這兩種與腫瘤免疫相關(guān)的細(xì)胞因子含量。
免疫組化結(jié)果顯示胡桃醌單獨(dú)應(yīng)用及胡桃醌與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用均能顯著降低腫瘤細(xì)胞增殖抗原ki-67和原癌基因Bcl-2基因的表達(dá)、增強(qiáng)與細(xì)胞粘性相關(guān)的E-鈣粘蛋白表達(dá)量及血管內(nèi)皮生長因子含量,說明能通過降低Bcl-2基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,同時(shí)能夠提高腫瘤細(xì)胞黏性,降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。胡桃醌對于小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞生長具有明確的體內(nèi)抑制作用,且能抑制血管生成,增強(qiáng)細(xì)胞粘性,降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。胡桃醌能增強(qiáng)機(jī)體免疫水平達(dá)到抗腫瘤的作用。
胡桃醌能增強(qiáng)5-FU對結(jié)腸癌的抑制作用,且胡桃醌與5-FU合用能明顯改善由于5-FU單獨(dú)用藥所引起的免疫器官指數(shù)降低和骨髓抑制所造成的白細(xì)胞數(shù)減少等副作用。胡桃醌可能的抗腫瘤機(jī)制是通過下調(diào)Bcl-2抑癌基因的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
參考文獻(xiàn)
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[5]張祥.胡桃醌及胡桃醌與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的體內(nèi)作用研究[D].北京理工大學(xué),2016.