背景^[1-3]

人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是一種人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的主要成分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a-MEM，L-DMEM，或DMEM-F12中任一種。

添加物包括人血白蛋白(HSA），胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（ITS），氫化可的松，維生素C（Vc），亞油酸，孕酮，丙酮酸鈉，非必需氨基酸，必需氨基酸，堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β)。

無血清培養(yǎng)基中HSA的添加量為100-1000μg/L，ITS的添加量為1-10ml/L，維生素C的添加量為10-30mg/L，氫化可的松添加量為10-50μg/L，亞油酸的添加量為1-10mg/L，丙酮酸鈉的添加量為50-150mg/L，孕酮的添加量為1-25μg/L，非必需氨基酸的添加量為10-20ml/L，必需氨基酸的添加量為10-20ml/L，bFGF的添加量為1-10μg/L，TGF-β的添加量為1-10μg/L。

傳統(tǒng)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基普遍由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）構(gòu)成。FBS中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

但FBS的添加也會(huì)產(chǎn)生一些問題或隱患：1）FBS易受病毒，支原體和其他病原體的污染，容易導(dǎo)致干細(xì)胞生產(chǎn)過程中發(fā)生污染；2）FBS的成分多樣且復(fù)雜，目前對(duì)其成分、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，有些可能對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制或毒害作用；3）FBS都是批量生產(chǎn)，各批次間的質(zhì)量差異造成干細(xì)胞終產(chǎn)品批次間的質(zhì)量差異；4）FBS中的某些成分難以徹底去除，嚴(yán)重影響最終產(chǎn)品質(zhì)量，具有安全隱患。

應(yīng)用^[4][5]

用于人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)研究

通過實(shí)驗(yàn)研究解決其中兩個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)問題,實(shí)現(xiàn)安全低成本的擴(kuò)增hES細(xì)胞和體外無血清培養(yǎng)體系下高效率的擴(kuò)增紅系祖細(xì)胞并向脫核紅細(xì)胞分化。希望通過解決以上兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題使hES細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化能夠更安全、高效,為最終誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞解決臨床輸血治療面臨的問題奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利用bFGF-hFLSCs作為人源化飼養(yǎng)層細(xì)胞體外擴(kuò)增hES細(xì)胞hES細(xì)胞建系和常規(guī)培養(yǎng)都是用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)做飼養(yǎng)層細(xì)胞或用MEF條件培養(yǎng)基(MEF conditional medium,MEF-CM)添加細(xì)胞因子在無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)hES細(xì)胞,這種異基因來源的飼養(yǎng)層給hES細(xì)胞的應(yīng)用帶來很大的安全風(fēng)險(xiǎn)。

為避免動(dòng)物源性飼養(yǎng)層可能帶來的污染,分離獲得了14周胎齡的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞系(human fetal liver stromal cells,hFLSCs),其在體外可以長(zhǎng)期培養(yǎng)擴(kuò)增,能夠傳代35次仍保持正常的核型,形態(tài)學(xué)及其表面標(biāo)志表達(dá)均類似人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)。

hFLSCs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞可以維持hES細(xì)胞的增殖傳代達(dá)10-15次,hFLSCs飼養(yǎng)層培養(yǎng)的hES細(xì)胞經(jīng)RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)均表達(dá)hES細(xì)胞特異性的標(biāo)志,并保持其干性特征。

免疫熒光結(jié)果表明hFLSCs和克隆邊緣分化hES細(xì)胞均表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(fibroblast growth factor receptor1,FGFR1),而未分化hES細(xì)胞表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor,IGF1R),提示bFGF通過作用于飼養(yǎng)層細(xì)胞和克隆邊緣少量分化的細(xì)胞來發(fā)揮其干性維持的作用。

bFGF是hES細(xì)胞體外培養(yǎng)中唯一必需的細(xì)胞因子,其在hES細(xì)胞的干性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

參考文獻(xiàn)

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