背景^[1-3]

StemXVivo Serum-Free Dendritic Cell Base Media(250 ML)是無血清樹突狀細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分確定不含血清成分可用于樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)因其表面具有星狀多形性或樹枝狀突起而得名,是科學(xué)家Ralph M.Steinman于1973年首先發(fā)現(xiàn)的。DC尚無特異性細(xì)胞表面分子標(biāo)志,主要通過形態(tài)學(xué)、組合性細(xì)胞表面標(biāo)志、在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中能激活初始T細(xì)胞等特征進(jìn)行鑒定。

DC起源自骨髓多能造血干細(xì)胞,分化主要有兩條途徑:①髓樣干細(xì)胞在GM-CSF的刺激下分化為DC,稱為髓樣DC(myeloid dendritic cells,MDC),也稱DC1,與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞;

②來源于淋巴樣干細(xì)胞,與T細(xì)胞和NK細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞,稱為淋巴樣DC(Lymphoid dendritic cells,LDC)或漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC),即DC2。DC廣泛分布于皮膚、氣道、淋巴器官等部位,具有高度異質(zhì)性,故不同組織中的DC有不同的名稱。如分布于皮膚表皮基底層和棘細(xì)胞之間的DC稱為朗格漢斯細(xì)胞。

DC的來源有兩條途徑：①髓樣干細(xì)胞在GM-CSF的刺激下分化為DC，稱為髓樣DC(myeloid dendritic cells，MDC)，也稱DCl，與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞；包括朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells，LCs），間皮（或真皮）DCs以及單核細(xì)胞衍生的DCs等。

②來源于淋巴樣干細(xì)胞，稱為淋巴樣DC(Lymophoid dendritic cells，LDC)或漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells，piX；)，即DC2，與T細(xì)胞和NK細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞(DC)盡管數(shù)量不足外周血單核細(xì)胞的1%，但表面具有豐富的抗原遞呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，是功能強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)。DC自身具有免疫刺激能力，是惟一能激活未致敏的初始型T細(xì)胞的APC。

應(yīng)用^[4][5]

用于小鼠骨髓源未成熟及成熟樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)及其上清液中細(xì)胞因子水平變化的研究

利用改良son法體外培養(yǎng)未成熟DC及成熟DC細(xì)胞,分析比較兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-23、IL-35的表達(dá)量,探討IL-23、IL-35在DC細(xì)胞的正性免疫應(yīng)答及免疫耐受機(jī)制中的意義,為MS的治療尋求新的方向。

方法:1離體分離培養(yǎng)未成熟及成熟樹突狀細(xì)胞取清潔級C57BL/6雌鼠,拉頸處死,依次浸泡于碘伏、75%酒精、75%酒精5min、2min、2min。無菌彎鑷及剪刀剝離干凈小鼠腿部肌肉,浸泡股骨于無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)之中2min,無菌紗布擦拭股骨表面,浸泡于含有青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中。

于股骨兩端及中央打孔,無菌RPMI-1640沖洗骨髓腔,200目細(xì)胞篩過濾、紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞、RPMI-1640清洗。使用含10%胎牛血清、10ng/ml白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)、10ng/ml粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(granulocytemacrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的RPMI-1640懸浮骨髓液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,接種于六孔板。

分別于48h、96h全量及半量換液,補(bǔ)充細(xì)胞因子,第5天收集懸浮細(xì)胞即為未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells,imDCs);第6天補(bǔ)充細(xì)胞因子干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ),第7天收集懸浮細(xì)胞即為成熟樹突狀細(xì)胞(mature dendritic cells,mDCs)。

分別收集第5天及第7天懸浮細(xì)胞,離心,CD11c標(biāo)記,無菌條件下經(jīng)流式細(xì)胞儀分選,收集CD11c+細(xì)胞,即為未成熟及成熟樹突狀細(xì)胞。

3細(xì)胞鑒定熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；掃描電鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞表面CD11c、MHCII、CD80、CD86分子表達(dá)情況分別于第5天及第7天收集六孔板中懸浮細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86的分子表達(dá)情況。

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