背景[1-3]
細(xì)胞增殖檢測(cè)是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，有多種顯示方法，除實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法之外，還可以進(jìn)行細(xì)胞分裂指數(shù)的測(cè)定。細(xì)胞分裂是細(xì)胞增殖的方式，能比較確切地反映細(xì)胞增殖度。細(xì)胞增殖是指細(xì)胞在周期調(diào)控因子的作用下通過(guò)DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等復(fù)雜反應(yīng)而進(jìn)行分裂的一系列過(guò)程。細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理和藥代動(dòng)力學(xué)等研究領(lǐng)域。
檢測(cè)細(xì)胞增殖的技術(shù)主要包括：
(1)滲透實(shí)驗(yàn)。這種方法用來(lái)染細(xì)胞膜破損的細(xì)胞,活細(xì)胞不會(huì)被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。然后通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器手動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。此方法快速、便宜、僅僅需要一少部分細(xì)胞。細(xì)胞傳代、凍存、或其它實(shí)驗(yàn)可以用這種方法?；蛘咭部梢酝ㄟ^(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。檢測(cè)前可以染PI排除死細(xì)胞。
(2) 直接增殖測(cè)定。這種方法利用DNA整合來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖。此方法利用整合到DNA中的放射性或非放射性的核酸類(lèi)似物來(lái)檢測(cè)。比如：Brdu免疫化學(xué)染色法需要將細(xì)胞或組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)變性處理,這就影響了標(biāo)本的結(jié)構(gòu),使標(biāo)本不適合下游實(shí)驗(yàn),也使得染色結(jié)果及程度過(guò)分地依賴于不同實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的不同條件。
(3) 細(xì)胞代謝法。這種方法是將四唑鹽加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),這些四唑鹽可以被活細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有顏色的甲瓚,用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定其光吸收值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。此方法已廣泛用于各種細(xì)胞增殖的檢測(cè),生物活性因子的活性檢測(cè),大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選,細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。
應(yīng)用[4][5]
用于細(xì)胞膜熒光染料用于定量檢測(cè)體內(nèi)外細(xì)胞增殖和肝脂肪酶在腫瘤細(xì)胞耐藥中的作用研究
在同一群腫瘤細(xì)胞中定量測(cè)定了各亞群細(xì)胞分裂次數(shù),同時(shí)保持細(xì)胞完整性,可繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞功能的測(cè)定,也可提取細(xì)胞蛋白和RNA進(jìn)行測(cè)定。
有研究指出APOBEC3G,、CD133、LIPC和S100P在功能上調(diào)節(jié)大腸癌的肝轉(zhuǎn)移,其陽(yáng)性預(yù)示著大腸癌存在肝轉(zhuǎn)移。另一項(xiàng)研究顯示非小細(xì)胞肺癌中LIPC表達(dá)水平可能具有一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值。
因此,本實(shí)驗(yàn)利用這種新的DiO染色方法研究了LIPC在腫瘤細(xì)胞耐藥中的機(jī)制。主要方法及結(jié)果1DiO的研究1.1DiO和DiD同屬親脂性羰花青染料。它們是由兩個(gè)對(duì)稱的環(huán),每個(gè)環(huán)連接一個(gè)長(zhǎng)的碳?xì)滏?環(huán)中間由奇數(shù)個(gè)次甲基連接構(gòu)成。雙環(huán)結(jié)構(gòu)及連接雙環(huán)的次甲基數(shù)目的不同決定了熒光分子的特性。
碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)短決定了它們與膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的親疏性。DiO的吸收和釋放波長(zhǎng)分別是484nm和501nnm,DiD的吸收和釋放波長(zhǎng)分別是644nm和665nm。1.2MTT測(cè)定DiO染色后細(xì)胞的增值情況。
結(jié)果顯示DiO染色后Lovo、SW480、SW620、CT26、HepG2細(xì)胞在1、2、3天不影響其增殖P>0.05。
參考文獻(xiàn)
[1]Marker-independent Method for Isolating Slow-Dividing Cancer Stem Cells in Human Glioblastoma[J].Cristina Richichi,Paola Brescia,Valeria Alberizzi,,Lorenzo Fornasari,Giuliana Pelicci.Neoplasia.2013(7)
[2]Prognostic value of LIPC in non-small cell lung carcinoma[J].Lorenzo Galluzzi,Aicha Goubar,Ken Olaussen,Ilio Vitale,Laura Senovilla,Judith Michels,Angélique Robin,Nicolas Dorvault,Benjamin Besse,Pierre Validire,Pierre fouret,Carmen Behrens,Ignacio Wistuba,Jean-Charles Soria,Guido Kroemer.Cell Cycle.2013(4)
[3]APOBEC3G promotes liver metastasis in an orthotopic mouse model of colorectal cancer and predicts human hepatic metastasis[J].Ding,Qingqing,Chang,Chun-Ju,Xie,Xiaoming,Xia,Weiya,Yang,Jer-Yen,Wang,Shao-Chun,Wang,Yan,Xia,Jiahong,Chen,Libo,Cai,Changchung,Li,Huabin,Yen,Chia-Jui,Kuo,Hsu-Ping,Lee,Dung-Fang,Lang,Jingyu,Huo,Longfei,Cheng,Xiaoyun,Chen,Yun-Ju,Li,Chia-Wei,Jeng,Long-Bin,Hsu,Jennifer L,Li,Long-Yuan,Tan,Alai,Curley,Steven A,Ellis,Lee M,DuBois,Raymond N,Hung,Mien-Chie.Journal of Clinical Investigation.2011(11)
[4]Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content[J].Salvatore Pece,Daniela Tosoni,Stefano Confalonieri,Giovanni Mazzarol,Manuela Vecchi,Simona Ronzoni,Loris Bernard,Giuseppe Viale,Pier Giuseppe Pelicci,Pier Paolo Di Fiore.Cell.2010(1)
[5]左俊華.細(xì)胞膜熒光染料用于定量檢測(cè)體內(nèi)外細(xì)胞增殖和肝脂肪酶在腫瘤細(xì)胞耐藥中的作用[D].南方醫(yī)科大學(xué),2014.