背景^[1-3]

生物素-標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)是羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)經(jīng)過生物素標(biāo)記的熒光標(biāo)記二抗，許多生物素分子可以與第二抗體偶聯(lián)，而鏈霉親和素的另一優(yōu)點(diǎn)是對生物素具有高親和力。通過該擴(kuò)增步驟并使抗生蛋白鏈菌素與標(biāo)記物（例如HRP或熒光探針）結(jié)合，更有可能檢測到低水平表達(dá)的蛋白質(zhì)。對于大多數(shù)測定，首先添加生物素標(biāo)記的第二抗體，然后依次加入與標(biāo)記物（例如HRP）偶聯(lián)的鏈霉親和素。

山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體是為了能和所有小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈起反應(yīng)的同類純化抗體準(zhǔn)備的。為了把交叉反應(yīng)的影響降到最低,相比于其他抗體,山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體應(yīng)優(yōu)先選擇從小鼠免疫球蛋白和血清中提取。標(biāo)記每個(gè)聚合物的標(biāo)準(zhǔn)是每一個(gè)免疫球蛋白分子用2-8個(gè)熒光團(tuán)或生物素分子標(biāo)記。在準(zhǔn)備階段,必須檢測樣品中有沒有非結(jié)合的染料,并且把樣品在無熒光實(shí)驗(yàn)中做檢測以確保較低的非特異性染色的可能。

生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L），使用抗原偶聯(lián)的瓊脂糖微珠從山羊抗血清內(nèi)親和色譜純化所得。免疫電泳和/或ELISA法檢測顯示本品特異性結(jié)合完整的小鼠IgG分子，也會(huì)與其他小鼠免疫球蛋白的輕鏈結(jié)合。生物素-標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)預(yù)先與相近物種包括人、牛、馬、兔、豬血清蛋白經(jīng)過親和吸附處理，ELISA和/或固相免疫吸附檢測證實(shí)與以上物種幾乎無交叉反應(yīng)。但可能會(huì)與其他物種免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。生物素-標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)不會(huì)識別非免疫球蛋白類的血清蛋白。

應(yīng)用^[4]

用于掃描電化學(xué)顯微術(shù)構(gòu)建酶圖形及全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)檢測鼠IgG

將原子力顯微鏡中的“蘸筆式”納米刻飾技術(shù)（Dip-Pen nanolithography，DPN）的理念運(yùn)用到SECM中，用掃描電化學(xué)顯微術(shù)“蘸筆法”構(gòu)建了辣根過氧化物酶（HRP）微米點(diǎn)。本章中我們首先研究了生物素化的HRP（Bio-HRP）在鉑電極上的吸附及脫吸特性，確定了在Bio-HRP鉑電極上吸附及脫吸的條件。吸附條件：電極在Bio-HRP溶液中浸泡5次，每次4mir；脫吸時(shí)間：60 min。在構(gòu)建HRP微米點(diǎn)時(shí)，先根據(jù)Bio-HRP在鉑電極上吸附的條件，將Bio-HRP吸附到自制的鉑微米電極上，然后將鉑電極在合適的電位下即-0.3 V（vs.Ag／AgCl）逼近到鏈霉親和素化的基底上方10μm左右，再將Bio-HRP從電極上自然脫吸，通過生物素與親和素的反應(yīng)將其固定到基底上得到微米點(diǎn)，并用SECM對其活性進(jìn)行了表征。同時(shí)在工作中為了減小HRP擴(kuò)散所引起的微米點(diǎn)的擴(kuò)大，在UME與基底之間形成一厚度為10μm左右的液膜，減小了分子擴(kuò)散對結(jié)果的影響。

用全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)對鼠IgG在單分子水平上進(jìn)行了免疫分析。先將蓋玻片硅烷化，在蓋玻片表面形成環(huán)氧基團(tuán)，然后在蓋玻片上加上鼠IgG溶液進(jìn)行孵育，使鼠IgG分子固定在玻片表面，加上BSA溶液將玻片未固定鼠IgG分子的地方封閉，然后將Alexa488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）溶液滴加在有鼠IgG溶液的地方進(jìn)行孵育，這樣就在有鼠IgG分子的地方接上了Alexa488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）分子，孵育完后將多余的Alexa488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）分子洗掉，用全內(nèi)反射熒光顯微鏡檢測Alexa488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）分子，通過檢測到的Alexa488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）分子的個(gè)數(shù)來確定鼠IgG分子的量。通過去除雜質(zhì)及降低所使用材料的熒光背景，使用全內(nèi)反射隱失場激發(fā)，減小激發(fā)體積，并使用適宜的濾波片，采用高靈敏度的檢測器ICCD對單個(gè)羊抗鼠IgG（H+L）分子進(jìn)行成像，具有非常高的靈敏度，在2.0×10-14mol／L-30×10-14mol／L的濃度范圍內(nèi)，檢測到的單分子的數(shù)目與溶液濃度有良好的線性關(guān)系。

參考文獻(xiàn)

[1]Optimization of Gold Nanoparticle-Based DNA Detection for Microarrays[J].Journal of Fluorescence.2005(2)

[2]Modification and characterization of artificially patterned enzymatically active surfaces by scanning electrochemical microscopy[J].Gunther Wittstock.Fresenius’Journal of Analytical Chemistry.2001(4)

[3]Local deposition and characterisation of K2Co[Fe(CN)6]and K2Ni[Fe(CN)6]by scanning electrochemical microscopy[J].Stefan Sauter,Gunther Wittstock.Journal of Solid State Electrochemistry.2001(3)

[4]李菲菲.掃描電化學(xué)顯微術(shù)構(gòu)建酶圖形及全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)檢測鼠IgG[D].山東大學(xué),2007.