背景[1-7]
TdT末端轉(zhuǎn)移酶是一種不依賴于模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3’羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物，加尾長度可達(dá)5~300nt。該末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）分子量為58.3 kDa，無5’和3’核酸外切酶活性，反應(yīng)中加入Co2+可提高加尾效率。該酶廣泛用于DNA的3’末端添加同聚物、利用修飾堿基（如ddNTP，DIGdUTP）標(biāo)記DNA 3’末端、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)（細(xì)胞凋亡的原位檢測）等試驗(yàn)。該酶經(jīng)檢測無DNA內(nèi)切酶和外切酶污染，不含RNase。
TdT末端轉(zhuǎn)移酶是一種模板非依賴型DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸重復(fù)添加到寡核苷酸、單鏈和雙鏈DNA的3'羥基端。TdT反應(yīng)需要含有至少3個(gè)堿基的短序列作為引物。以RNA為模板時(shí)，TdT性能嚴(yán)格依賴于受體RNA 3’-末端的三級結(jié)構(gòu)和核苷酸的種類。一般TdT對RNA模板的作用效率比DNA模板低。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT,簡稱末端轉(zhuǎn)移酶)，是從動(dòng)物(通常是牛)胸腺和骨髓中分離提取的。
末端轉(zhuǎn)移酶催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3'-OH末端，催化作用不需要模板，但需Co2+的存在。末端轉(zhuǎn)移酶可給一群DNA分子的3'-OH末端接上寡dA或dC,而給另一群DNA分子的3'-OH末端接上寡dT或dG,兩群分子混合即可使同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。末端轉(zhuǎn)移酶在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。它可以被用來在cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)中來添加"核苷酸"(nucleotide)，然后可以用來作為在后續(xù)PCR的"引物"(primer)的模板。
它也可以用于添加標(biāo)記放射性同位素的核苷酸，例如在TUNEL檢測(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶"dUTP缺口末端標(biāo)記"(dUTP Nick End Labeling))，用于細(xì)胞凋亡的示范(其中的標(biāo)記，在某種程度上，通過片段化DNA來進(jìn)行)。也可用于治療"急性淋巴性白血病"診斷之"免疫熒光測定"(immuno-fluorescence)。
在免疫組織化學(xué)中，抗體TdT酶可用于顯示未成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞以及多能的"造血(Haematopoiesis)干細(xì)胞"的存在，其具有抗原，而成熟的淋巴樣細(xì)胞總是呈"TdT陰性"。而末端轉(zhuǎn)移酶陽性的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)少量的健康淋巴結(jié)和扁桃體，急性淋巴細(xì)胞白血病的惡性細(xì)胞也呈"TdT陽性"，而抗體，因此可以被用來作為面板診斷及區(qū)別這種疾病的一部分，比如，"初發(fā)期的小細(xì)胞腫瘤"(small cell tumours of childhood)。
注意事項(xiàng)
1、適量EDTA可使Terminal Transferase的活性喪失。
2、金屬離子螯合劑，較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對Terminal Transferase活性具有抑制作用。
應(yīng)用[8][9]
合成同聚物和雜聚物；線性雙鏈DNA的3’-OH末端同聚物加尾；寡聚脫氧核苷酸和DNA標(biāo)記；5’-RACE(快速擴(kuò)增cDNA末端)；凋亡反應(yīng)的原位定位。
末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途包括:
(1)給載體或CDNA加上互補(bǔ)的同聚尾(用于建立體外重組DNA分子時(shí)在DNA片段末端加上一一個(gè)同聚物尾巴，兩種不同的DNA分子加上不同的但可以互補(bǔ)的即A和T、C和G的尾巴后，經(jīng)過退火或復(fù)性，兩種尾巴便可以借助互補(bǔ)作用連接在一起)。在CDNA文庫建立時(shí)，這種加尾方法是使CDNA插人載體中的常用方法之一。
(2)用于DNA片段3'末端的放射性核素標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶在Mg2*存在的條件下，選擇3'-OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在CO+存在的條件下，選擇3'-OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。如果在反應(yīng)系統(tǒng)中加人核素標(biāo)記的核苷酸，那么便可得到3'端標(biāo)記的DNA分子。該法常用于核酸末端標(biāo)記和核酸連接的互補(bǔ)多聚尾(連接頭)。
參考文獻(xiàn)
[1]Interleukin-12B rs3212227 polymorphism and cancer risk:a meta-analysis[J].Huilong Chen,Sheng Cheng,Jianmiao Wang,Chao Cao,Hansvin Bunjhoo,Weining Xiong,Yongjian Xu.Molecular Biology Reports.2012(12)
[2]Interactions of interleukin-12A and interleukin-12B polymorphisms on the risk of intracranial aneurysm[J].Li-Juan Li,Xin-Min Pan,Xiutian Sima,Zhao-Hui Li,Lu-Shun Zhang,Hong Sun,Yi Zhu,Wei-Bo Liang,Lin-Bo Gao,Lin Zhang.Molecular Biology Reports.2012(12)
[3]Monocytes expression of IL-12 related and IL-10 genes in association with development of colorectal cancer[J].Noyko S.Stanilov,Lyuba D.Miteva,Zlatka G.Dobreva,Jovcho P.Jovchev,Geo M.Cirovski,Spaska A.Stanilova.Molecular Biology Reports.2012(12)
[4]Associations between polymorphisms in IL-12A,IL-12B,IL-12Rβ1,IL-27 gene and serum levels of IL-12p40,IL-27p28 with esophageal cancer[J].Yi-Peng Tao,Wan-Ling Wang,Song-Yue Li,Jian Zhang,Qi-Zhong Shi,Fen Zhao,Bao-Sheng Zhao.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology.2012(11)
[5]Quantification of interferon,interleukin,and Toll-like receptor 7 mRNA in quail splenocytes using real-time PCR[J].Y.Uno,T.Usui,Y.Fujimoto,T.Ito,T.Yamaguchi.Poultry Science.2012(10)
[6]Functional polymorphisms in the interleukin-12 gene contribute to cancer risk:Evidence from a meta-analysis of 18 case–control studies[J].Liping Zhou,Fan Yao,Hong Luan,Yinling Wang,Xihua Dong,Wenwen Zhou,Qihui Wang.Gene.2012(1)
[7]Association of polymorphisms of cytokine and TLR-2 genes with long-term immunity to hepatitis B in children vaccinated early in life[J].Yangyang Wang,Peizhen Xu,Dongmei Zhu,Shu Zhang,Yongchun Bi,Yali Hu,Yi-Hua Zhou.Vaccine.2012(39)
[8]The Association of IL-12b Polymorphisms with Systemic Lupus Erythematosus in Chinese Han Population[J].Yong Shao,Jie Zhang,Yuewen Chen,Qi Wu,Ming Guan,Bo Yu,Jun Wan,Wei Zhang,Javier Martin.International Journal of Rheumatology.2012
[9]張?jiān)賯?白細(xì)胞介素12B基因多態(tài)性與早發(fā)冠心病相關(guān)性研究[D].南方醫(yī)科大學(xué),2013.