背景[1-7]
Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)用純化的小鼠IgG免疫山羊，然后用親和純化柱對獲得的抗血清進(jìn)行純化，并經(jīng)過人IgG吸附純化的優(yōu)質(zhì)二抗。對人IgG幾乎沒有結(jié)合能力。Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)與小鼠IgG分子和IgM分子有特異性反應(yīng)，與其它小鼠免疫球蛋白（包括IgE、IgD、IgA等）的輕鏈有交叉反應(yīng)。該二抗與血清內(nèi)非免疫球蛋白無交叉反應(yīng)。
通過血清吸附處理，其與人、牛、馬血清內(nèi)蛋白（包括免疫球蛋白）的交叉反應(yīng)降到最低，但可能與除此以外其它種屬的免疫球蛋白有交叉反應(yīng)。Cy3是一種紅色熒光探針。它比絕大部分其它的紅色熒光探針更加明亮，更加不容易淬滅，而且背景更低。Cy3激發(fā)光波長為570nm，發(fā)射光波長為650nm，呈綠色熒光。但是在綠光光譜波長激發(fā)下，Cy3也可出現(xiàn)紅色熒光。
Cy3屬于花菁類染料（Cyanine Dyes），常見的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等，能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50%的光強(qiáng)，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75%的光強(qiáng)。
Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC，在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體是為了能和所有小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈起反應(yīng)的同類純化抗體準(zhǔn)備的。
為了把交叉反應(yīng)的影響降到*,相比于其他抗體,山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體應(yīng)優(yōu)先選擇從小鼠免疫球蛋白和血清中提取。標(biāo)記每個聚合物的標(biāo)準(zhǔn)是每一個免疫球蛋白分子用2-8個熒光團(tuán)或生物素分子標(biāo)記。在準(zhǔn)備階段,必須檢測樣品中有沒有非結(jié)合的染料,并且把樣品在無熒光實(shí)驗(yàn)中做檢測以確保較低的非特異性染色的可能。
應(yīng)用[8][9]
Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)可用于細(xì)胞或組織內(nèi)的微管(microtubule)的熒光檢測?？梢杂糜跓晒怙@微鏡觀察，也可用于流式細(xì)胞儀檢測。
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的偶蹄動物易得的一種烈性疾病,對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,FMD疫苗的研制也從傳統(tǒng)疫苗轉(zhuǎn)向新型疫苗,其中表位疫苗因其呈現(xiàn)出諸多優(yōu)勢而成為疫苗研究的熱點(diǎn),如能被多種遺傳背景的MHC分子識別并結(jié)合,使抗原得到高效的遞呈,因此在有效的應(yīng)對病原微生物的變異以及免疫反應(yīng)中的諸多不利因素等免疫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
嵌入型蛋白SLP-Multi VP1與重組蛋白SLP免疫6周齡的昆明小鼠,以PBS作為陰性對照組。小鼠經(jīng)三次免疫后,摘取其脾臟組織分離總淋巴細(xì)胞,按既定方法處理并通過流式細(xì)胞儀分析各免疫組小鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞的變化,試驗(yàn)結(jié)果顯示:嵌入型蛋白SLP-Multi VP1免疫組的CD4+T與CD8+T數(shù)量高于SLP免疫組及PBS對照組,差異顯著(P<0.05)。
該結(jié)果提示嵌入型蛋白SLP-Multi VP1可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。將嵌入型蛋白SLP-Multi VP1與重組蛋白SLP免疫6周齡的BALB/c小鼠和昆明小鼠,用間接ELISA方法檢測了三次免疫后各組小鼠的總Ig G水平,試驗(yàn)結(jié)果顯示,2種小鼠均能產(chǎn)生較高滴度的Ig G(P<0.05),該結(jié)果表明嵌入型蛋白SLP-Multi VP1具有良好的抗原性,并且2種小鼠的Ig G水平差異不顯著(P>0.05),表明不同種小鼠間無差異性。
經(jīng)第三次免疫后,采集BALB/c和昆明小鼠的血清,采用Ig G亞型ELISA試劑盒(e Bioscience公司)進(jìn)行檢測Ig G1和Ig G2a水平,獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS統(tǒng)計學(xué)分析,試驗(yàn)結(jié)果顯示:在兩種免疫動物小鼠模型中,嵌入型蛋白SLP-Multi VP1組Ig G1和Ig G2a水平均高于SLP免疫組,差異顯著(P<0.05)。另外,在嵌入型蛋白SLP-Multi VP1免疫組中,Ig G2a的水平高于Ig G1,差異顯著(P<0.05)。而在SLP免疫組中,Ig G1和Ig G2a水平差異不顯著(P>0.05),該結(jié)果提示嵌入型蛋白SLP-Multi VP1可能傾向于激發(fā)Th1類免疫應(yīng)答。
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