背景^[1-3]

CIDEC抗體是一種可以特異性結(jié)合CIDEC的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CIDEC蛋白。CIDEC抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

CIDEC，即誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的DFF45樣效應(yīng)因子C，別名FSP27。它是一種在小鼠脂肪細(xì)胞中首次分離得到的蛋白質(zhì)，隨后在人類肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，屬于CIDE家族。CIDEC在脂滴表面定位，通過在脂滴間形成特殊的孔/通道樣結(jié)構(gòu)，促進(jìn)脂質(zhì)從小脂滴轉(zhuǎn)移到大脂滴，從而調(diào)節(jié)脂肪代謝和機(jī)體能量平衡。CIDEC不僅在促進(jìn)脂肪儲存和脂滴體積增大中發(fā)揮作用，還在細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。CIDEC的異常表達(dá)與多種代謝性疾病相關(guān)，如肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝病等。

CIDEC抗體

CIDEC抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（CIDEC抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CIDEC抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

CIDEC抗體可以用于CIDEC在人脂肪細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究

研究CIDEC在人類脂肪細(xì)胞分化中的作用,期望為今后治療肥胖提供新的靶點(diǎn)。目的1、研究CIDEC的表達(dá)與脂肪細(xì)胞分化的關(guān)系;2、研究CIDEC的亞細(xì)胞定位;3、研究下調(diào)CIDEC表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。

方法：1、利用CIDEC抗體免疫組織化學(xué)、Real-time PCR和Western blot方法檢測CIDEC在不同發(fā)育階段的人胚胎脂肪組織以及不同分化程度脂肪腫瘤組織中的表達(dá)變化;2、構(gòu)建CIDEC與熒光蛋白融合表達(dá)的質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,以確定CIDEC蛋白的亞細(xì)胞定位。3、體外原代培養(yǎng)人前脂肪細(xì)胞,并進(jìn)行誘導(dǎo)分化,檢測不同分化階段CIDEC的表達(dá)水平。4、利用慢病毒siRNA沉默CIDEC的表達(dá),以研究下調(diào)CIDEC表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化的影響,并分析其機(jī)制。

結(jié)果：1、CIDEC的表達(dá)水平與脂肪細(xì)胞的分化相關(guān)采用CIDEC抗體免疫組織化學(xué)、Real-time PCR和Western blot方法比較了3例不同發(fā)育階段的胎兒脂肪組織中CIDEC的表達(dá)情況,同時(shí)檢測調(diào)控脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵分子PPARγ的變化。結(jié)果顯示,無論mRNA還是蛋白水平,CIDEC均呈現(xiàn)隨著分化成熟逐漸增高的趨勢,并且與PPARγ的表達(dá)趨勢完全一致。對30例人體正常脂肪組織和45例不同分化程度的脂肪腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,CIDEC隨著脂肪細(xì)胞分化程度降低而表達(dá)降低。采用Real-time PCR和Western blot方法的研究結(jié)果顯示,同正常脂肪組織相比,脂肪瘤中CIDEC的表達(dá)變化不顯著,而分化好的脂肪肉瘤、黏液型脂肪肉瘤及去分化脂肪肉瘤中CIDEC的表達(dá)均顯著降低(n=5,*p<0.05)。此外,通過體外實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)人前脂肪細(xì)胞,并誘導(dǎo)成為成熟脂肪細(xì)胞,隨著脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成熟,CIDEC和PPARγ的表達(dá)水平同誘導(dǎo)前相比急劇升高(*p<0.05),同脂肪分化標(biāo)志分子FABP4變化趨勢一致。以上體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,CIDEC在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。

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