背景[1-3]
FOXO1A抗體是一種特異性識別和結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子FoXo1（Forkhead box protein O1）的抗體。FoXo1是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種生物過程，包括細(xì)胞周期、代謝、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激響應(yīng)等。
通過使用FoXo1抗體，研究人員可以檢測和定量FoXo1在細(xì)胞或組織樣品中的表達(dá)水平，進而了解其在相關(guān)生物過程中的功能和調(diào)控機制。常見的應(yīng)用包括免疫印跡（Western blotting）、免疫組化（immunohistochemistry）和免疫熒光染色（immunofluorescence）等。
FOXO1A：叉頭家族的轉(zhuǎn)錄因子可能在肌源性生長和分化中發(fā)揮重要作用，并通過控制脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）的表達(dá)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的脂肪分解，ATGL是一種限速脂肪分解酶。PAX3基因易位與肺泡橫紋肌肉瘤有關(guān)。
FOXO1A抗體
FOXO1A抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉(zhuǎn)膜與封閉
1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。
3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（FOXO1A抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(FOXO1A抗體)。
3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應(yīng)用[4][5]
FOXO1A抗體可以用于PCOS大鼠卵巢中Foxo1a基因的表達(dá)及其可能作用的初步探討
PCOS大鼠卵巢中Foxo1a的表達(dá)及其可能作用目的:檢測Foxo1a基因在PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá),并比較其與性激素及胰島素抵抗之間的關(guān)系,探討其在PCOS發(fā)病中的可能作用。
方法:PCOS模型組和對照組中的部分卵巢行石蠟切片卵巢包埋,采用FOXO1A抗體免疫組織化學(xué)SABC法檢測Foxo1a(phospho S256)在卵巢中的顆粒細(xì)胞的表達(dá),部分卵巢用于提取顆粒細(xì)胞,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定卵巢顆粒細(xì)胞中的Foxo1a在細(xì)胞的mRNA的表達(dá)水平。將PCOS模型組卵巢顆粒細(xì)胞中的Foxo1a在細(xì)胞的mRNA的相對表達(dá)水平量值與血清激素及胰島素抵抗等進行相關(guān)性檢驗。
FOXO1A抗體結(jié)果:⑴免疫組織化學(xué)SABC法顯示PCOS模型組和對照組卵巢顆粒細(xì)胞中均有Foxo1a蛋白的表達(dá),但兩組卵巢顆粒細(xì)胞中的定位有明顯的不同,在PCOS模型組中主要定位于細(xì)胞胞核,而在對照組中主要定位于胞漿;PCOS模型組Foxo1a蛋白表達(dá)顯著高于對照組(203.1±50.34 vs 532.4±119.19,P<0.01)。⑵RT-PCR法檢測結(jié)果顯示,PCOS模型組中的顆粒細(xì)胞Foxo1a的mRNA的表達(dá)顯著高于對照組(0.7858±0.0711 vs 0.4619±0.0113,P<0.01)。⑶PCOS模型組中,Foxo1a的mRNA表達(dá)與其血清雄激素正相關(guān),與血清LH、E2、FBG、FINS以及HOMA1-IR無相關(guān)性。
參考文獻(xiàn)
[1]Expression of forkhead transcription factors in human granulosa cells[J].Margareta D.Pisarska;;Fang-Ting Kuo;;Dahai Tang;;Parham Zarrini;;Salma Khan;;Aline Ketefian.Fertility and Sterility,2009(4)
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[3]Association of Common Genetic Variation in the FOXO1 Gene withβ-Cell Dysfunction,Impaired Glucose Tolerance,and Type 2 Diabetes[J].Karsten Müssig;;Harald Staiger;;Fausto Machicao;;Alena Stan?áková;;Johanna Kuusisto;;Markku Laakso;;Claus Thamer;;Jürgen Machann;;Fritz Schick;;Claus D.Claussen;;Norbert Stefan;;Andreas Fritsche;;Hans-Ulrich H?ring.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2009
[4]OutFOXOing disease and disability:the therapeutic potential of targeting FoxO proteins[J].Kenneth Maiese;;Zhao Zhong Chong;;Yan Chen Shang.Trends in Molecular Medicine,2008(5)
[5]柳先廉.PCOS大鼠卵巢中Foxo1a基因的表達(dá)及其可能作用的初步探討[D].華中科技大學(xué),2010.