背景[1-3]
SMAD5抗體是一種可以特異性結合SMAD5的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的SMAD5蛋白。SMAD5抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。
SMAD5，也稱為MADH5和JV5-1，是一種由BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）1型受體激酶激活的轉錄調節(jié)劑。SMAD5是一種受體調節(jié)的SMAD（R-SMAD）。它在TGF-β抑制人造血祖細胞增殖的信號通路中起關鍵作用。
SMAD5抗體
SMAD5抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉膜與封閉
1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。
3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（SMAD5抗體按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(SMAD5抗體)。
3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應用[4][5]
SMAD5抗體可以用于BMPR2/SMAD5信號通路對雞顆粒細胞增殖、凋亡及類固醇激素合成的影響
以產蛋雞的正常發(fā)育卵泡和就巢雞的閉鎖卵泡進行轉錄組測序,并篩選可能參與調控雞卵泡發(fā)育的信號通路,然后在體外培養(yǎng)的雞顆粒細胞中干擾和過表達該通路中上下游關鍵基因后檢測對細胞增殖、凋亡以及類固醇激素合成的影響,并外源添加信號通路抑制劑后影響顆粒細胞的生長發(fā)育情況,以期明確信號通路在雞卵泡顆粒細胞發(fā)育中的作用。
主要研究結果如下:(1)對產蛋雞正常卵泡和就巢雞的閉鎖卵泡進行轉錄組測序后對比發(fā)現(xiàn)了200個表達差異顯著的基因,其中有131個上調基因和69個下調基因,SMAD5抗體結果顯示包括SMAD5與BMPR2。GO富集分析顯示在生物過程中主要與細胞活化調節(jié)、淋巴細胞活化調節(jié)、白細胞活化的負調節(jié)和增殖關聯(lián)密切;細胞組分中主要為中間絲細胞骨架、免疫突觸等;分子功能主要為結合和催化活性。KEGG富集分析通路發(fā)現(xiàn),差異基因富集到的前20個通路主要是TGF-β信號通路、細胞粘聯(lián)分子(CAMs)等,其中TGF-β信號轉導通路與卵泡的生長發(fā)育密切相關。
(2) 在體外培養(yǎng)的雞原代顆粒細胞中干擾BMPR2表達后,顯著提高了細胞增殖相關基因PCNA、CDK2以及CCND1的m RNA表達水平;CCK8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)顆粒細胞增殖效率明顯升高;Ed U染色顯示陽性細胞數(shù)量顯著增加;細胞中的凋亡相關因子(Caspase-3與Caspase-9)表達量顯著降低;促進細胞中雌激素(E2)和孕酮(P4)的分泌以及相關基因CYP11A1和CYP19A1的表達,以上結果表明BMPR2可抑制雞顆粒細胞增殖、促進細胞凋亡。
(3)SMAD5抗體結果顯示在體外培養(yǎng)的雞原代顆粒細胞中過表達SMAD5,細胞增殖基因PCNA、CDK2以及CCND1的m RNA表達量和蛋白水平表達量均顯著降低,而凋亡相關基因Caspase-3與Caspase-9的表達量顯著上升;CCK8與Ed U檢測均顯著細胞增殖效率顯著降低,E4與P2的合成及其相關基因的m RNA表達量與蛋白水平表達量也顯著下降。然而,在細胞中干擾SMAD5表達后,得到與上述相反的結果。以上結果表明SMAD5可抑制雞卵泡顆粒細胞增殖、促進細胞凋亡。(4)在體外原代顆粒細胞中干擾BMPR2表達后SMAD5抗體結果發(fā)現(xiàn)SMAD5的表達量下降,可對BMP/SMAD信號通路造成抑制作用。
參考文獻
[1]Vascular-Parenchymal Crosstalk Promotes Lung Fibrosis Through BMPR2 Signaling.[J].Yanagihara Toyoshi;Tsubouchi Kazuya;Zhou Quan;Chong Michael;Otsubo Kohei;Isshiki Takuma;Schupp Jonas C;Sato Seidai;Scallan Ciaran;Upagupta Chandak;Revill Spencer;Ayoub Anmar;Chong Sy Giin;DvorkinGheva Anna;Kaminski Naftali;Tikkanen Jussi;Keshavjee Shaf;ParéGuillaume;Guignabert Christophe;Ask Kjetil;Kolb Martin Rj.American journal of respiratory and critical care medicine.2023
[2]Expression Patterns and Gonadotropin Regulation of the TGF-βII Receptor(Bmpr2)during Ovarian Development in the Ricefield Eel Monopterus albus[J].He Zhi;Zheng Li;Chen Qiqi;Xiong Sen;He Zhide;Hu Jiaxiang;Ma Zhijun;Zhang Qian;He Jiayang;Ye Lijuan;He Liang;Luo Jie;Gu Xiaobin;Zhang Mingwang;Tang Ziting;Jiao Yuanyuan;Pu Yong;Xiong Jinxin;Gao Kuo;Lai Bolin;Yang Shiyong;Yang Deying;Yan Taiming.International Journal of Molecular Sciences.2022
[3]BMP/Smad Pathway Is Involved in Lithium Carbonate-Induced Neural-Tube Defects in Mice and Neural Stem Cells[J].Yang Aiyun;Li Shen;Zhang Yan;Wang Xiuwei;Guan Zhen;Zhu Zhiqiang;Liang Yingchao;Zhao Lijiao;Wang Jianhua.International Journal of Molecular Sciences.2022
[4]Leptin promotes primordial follicle activation by regulating ovarian insulin-like growth factor system in chicken.[J].Ahmadi Sadequllah;Ohkubo Takeshi.Endocrinology.2022
[5]王蘇文.BMPR2/SMAD5信號通路對雞顆粒細胞增殖、凋亡及類固醇激素合成的影響[D].四川農業(yè)大學,2023.