背景[1-3]
CD20(抗體)是一種可以特異性結合PDX1的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PDX1蛋白。CD20(抗體)可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。
CD20（Cluster of Differentiation 20）是一種跨膜磷蛋白，位于B淋巴細胞表面。B淋巴細胞是由骨髓內多能干細胞分化而成，其發(fā)育經過祖B細胞（Pro-B），前B細胞（Pre-B），不成熟B細胞（Immature B）以及成熟B細胞（Mature B）幾個階段。成熟B細胞被釋放至淋巴組織，可繼續(xù)分化為漿細胞（Plasma Cell）。CD20作為B細胞的表面抗原，出現在前B細胞到成熟B細胞階段，但是CD20并不表達在造血干細胞，祖B細胞以及成熟的漿細胞上。在人體中，CD20表面抗原是由MS4A1基因編碼的。
除在正常B細胞中表達外，CD20還在B細胞來源的淋巴瘤、白血病等的腫瘤細胞表達，以及和涉及免疫疾病和炎癥疾病的B細胞中表達，所以CD20抗原成為淋巴癌、白血病和某些自體免疫等疾病治療的目標靶點。
CD20(抗體)
CD20(抗體)使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉膜與封閉
1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。
2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。
3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（CD20(抗體)按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CD20(抗體))。
3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應用[4][5]
CD20(抗體)可以用于抗CD20單克隆抗體治療對小鼠肺腺癌的影響
構建T739小鼠肺腺癌腫瘤模型,通過在腫瘤發(fā)展的不同時期注射抗CD20單克隆抗體,探究抗CD20單克隆抗體對肺腺癌發(fā)展不同階段的作用以及對腸道菌群和相關免疫細胞的影響。
方法：通過皮下注射小鼠肺腺癌細胞系LA795構建T739小鼠肺腺癌模型。在皮下荷瘤模型的基礎上,將小鼠分為三組;荷瘤前注射抗CD20單抗組、成瘤后注射抗CD20單抗組與對照荷瘤組;抗CD20單抗處理組分別在荷瘤前后通過尾靜脈對小鼠注射抗CD20單抗,對照組注射相同劑量的PBS。各組分別繪制腫瘤生長曲線,記錄腫瘤的體積和質量;采用HE染色與CD20(抗體)免疫熒光技術,觀察皮下腫瘤組織的結構以及T細胞的分布;同時采用流式細胞術分別檢測不同皮下荷瘤組小鼠外周血與脾中B細胞的比例,以及皮下荷瘤小鼠引流淋巴結中B細胞、T細胞和NK細胞的比例及活化狀態(tài);之后基于邊合成邊測序技術,利用Illumina平臺對腫瘤組織中的c DNA進行了高通量測序,進行差異表達基因功能注釋及富集分析;最后基于Illumina Novaseq測序平臺,利用雙末端測序的方法,構建小片段文庫對小鼠腸道微生物群進行差異分析。
CD20(抗體)結果1.肺腺癌荷瘤小鼠模型的建立:對T739小鼠皮下注射1x106個LA795小鼠肺腺癌細胞,皮下可見腫瘤生長;取腫瘤組織HE染色,鏡下可見大量排列緊密,核大深染的細胞。2.不同時間注射抗CD20單抗對肺腺癌生長的影響:(1)荷瘤前注射抗CD20單抗組小鼠的腫瘤體積顯著小于對照組小鼠(P<0.01),成瘤后注射抗CD20單抗組小鼠的腫瘤體積與對照組無顯著差異(P>0.05)。(2)HE染色結果表明,與對照組相比,荷瘤前注射抗CD20單抗組腫瘤細胞壞死明顯,表現為核破裂、固縮,腫瘤的內部結構更加松散,而成瘤后再注射抗CD20單抗組腫瘤內部無明顯壞死。3.免疫熒光結果顯示,與對照組相比,荷瘤前注射抗CD20單抗組腫瘤內的CD4+T細胞浸潤顯著增加,且CD4+T和CD8+T細胞呈共定位現象,有利于二者的相互活化。
參考文獻
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[5]王灝琦.抗CD20單克隆抗體治療對小鼠肺腺癌的影響[D].錦州醫(yī)科大學,2022.