背景^[1-3]

DELAFIELD蘇木素染色液是一種用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的染色劑，特別適用于非木質(zhì)化組織的染色。這種染色液主要由蘇木精和其他成分組成，可以與番紅對(duì)染，對(duì)多種植物病害組織染色能夠取得良好的效果。

在染色過程中，蘇木精作為一種堿性天然染料，可以使細(xì)胞核著色。這是因?yàn)榧?xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的主要成分是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。

Delafield蘇木素染色液的使用方法通常包括將組織切片浸泡在染色液中一定時(shí)間，然后進(jìn)行清洗和分化處理。在HE染色中，常用1%鹽酸乙醇作為分化液，因?yàn)樗崮芷茐奶K木素的醌型結(jié)構(gòu)，使組織與色素分離而退色。此外，染色液還需要在特定的保存條件下保存，如室溫、避光等。

DELAFIELD蘇木素染色液

Delafield蘇木素是通過對(duì)蘇木素進(jìn)行自然氧化處理而制成的，這一過程涉及將蘇木素暴露于光和空氣中，讓其自然氧化成蘇木紅。這個(gè)過程比較緩慢，通常需要3到6個(gè)月的時(shí)間。經(jīng)過這樣處理的蘇木素染色能力可以維持很長(zhǎng)時(shí)間。在使用Delafield蘇木素染色液之前，建議先進(jìn)行過濾，以確保染色效果。

在實(shí)驗(yàn)室中，Delafield蘇木素染色液主要用于染色細(xì)胞核，其染色結(jié)果呈現(xiàn)出紫色或藍(lán)紫色，便于在顯微鏡下觀察和分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)。由于其優(yōu)異的染色能力和較長(zhǎng)的可用期限，Delafield蘇木素染色液成為了科研和病理診斷中非常受歡迎的一種染色劑。

應(yīng)用^[4][5]

DELAFIELD蘇木素染色液可以用于Eya2在前列腺癌中過表達(dá)，通過AKT/Bcl-2通路調(diào)控前列腺癌細(xì)胞線粒體功能及多西紫杉醇敏感性

探究Eya2在前列腺癌中的表達(dá)模式,臨床意義,表達(dá)差異對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響以及潛在的分子生物學(xué)機(jī)制,以判斷Eya2是否可能作為前列腺癌早期診斷的生物標(biāo)記物。

研究方法:1組織樣本98例人類前列腺癌組織和16例前列腺正常組織來自于2013至2016年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院就診的患者。2免疫組織化學(xué)前列腺癌組織樣本切除后浸入甲醛溶液固定,石蠟包埋處理并保存。制作石蠟切片,脫蠟后經(jīng)抗原修復(fù)、BSA封閉后,滴加一抗(Eya2)孵育過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育?？贵w孵育結(jié)束后DAB顯色試劑盒顯色,DELAFIELD蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核,脫水透化后進(jìn)行封片。統(tǒng)計(jì)染色強(qiáng)度和陽性百分比,估算Eya2在前列腺組織中的表達(dá)情況。3細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系為:人類前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)),人類前列腺癌細(xì)胞DU145(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)),LNCaP(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)),PC-3(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)),人類293細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。培養(yǎng)條件為:含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基,37℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)。4 Western Blot收集蛋白進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳,所用一抗為:Eya2、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase3、PRAP、AKT、p-AKT、Bcl-2、MMP7和actin。樣本經(jīng)過辣根過氧化物酶耦合二抗孵育2小時(shí),ECL發(fā)光。5實(shí)時(shí)定量RT-PCR使用TRIZOL提取總RNA,使用iScriptTM Reverse Transcription Supermix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR使用SYBR Green MasterMix試劑采集熒光信號(hào)。所用儀器為ABI 7500。actin為內(nèi)參基因,基因擴(kuò)增倍數(shù)參照2-ΔΔct法。

6 Eya2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和shEya2穩(wěn)轉(zhuǎn)Eya2 shRNA、pMD2.G和pspax2均購(gòu)于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染,puromycin進(jìn)行細(xì)胞篩選。Eya2質(zhì)粒購(gòu)于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000進(jìn)行Eya2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。7 CCK8和集落形成實(shí)驗(yàn)CCK8:重懸處理后細(xì)胞,以3000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板,分別在24h、48h、72h、96h使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,繪制折線圖觀測(cè)Eya2表達(dá)差異對(duì)細(xì)胞增殖的影響。集落形成實(shí)驗(yàn):重懸處理后細(xì)胞,均勻接種于6cm皿中,連續(xù)培養(yǎng)2周。固定后吉薩姆染色液染色,晾干后采集圖像。對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù),分析Eya2表達(dá)差異對(duì)集落形成的影響。8 Transwell凝膠侵襲實(shí)驗(yàn)將處理后細(xì)胞重懸加至包被有Matrigel的Transwell上室中。Transwell上室血清濃度為3%,下室血清濃度為13%,37℃飽和濕度培養(yǎng)18h。取出上室,擦去上層Matrigel,固定打孔并使用DELAFIELD蘇木素染色液染色。風(fēng)干后裁下基底膜,中性樹膠封片。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),分析Eya2表達(dá)差異對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。

參考文獻(xiàn)

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