背景技術

糠醛是一種重要的生物基平臺化合物(Green Chem.2010,12,539)，主要以農(nóng)業(yè)廢棄物如糧食作物殘渣或木材廢物為原料制備得到。當前，糠醛全球年產(chǎn)量約為28萬噸(Energy Environ.Sci.2016,9,1144)。其中，我國為糠醛主要生產(chǎn)國，全球70％的糠醛是由我國生產(chǎn)的?？啡┓肿又泻腥┗头枷汶s環(huán)，易進一步高值化轉化為各種高附加值化學品。糠醇是糠醛分子中醛基選擇性還原產(chǎn)物，在醫(yī)藥、高分子、食品等領域具有重要的應用價值。據(jù)報道，約65％糠醛被用于生產(chǎn)糠醇?？反疾粌H可以用于合成生產(chǎn)優(yōu)質芯模的高性能樹脂、聚氨酯泡沫及聚酯等高分子材料，而且還是制備生物基燃料、四氫糠醇、抗?jié)兯幬锢啄崽娑〖跋闼鹊闹匾虚g體(Energy Environ.Sci.2016,9,1144；ACS SustainableChem.Eng.2015,3,1263)。

當前，工業(yè)上糠醇主要是通過糠醛催化加氫制備得到，既可以在液相體系反應得到，也可以通過氣相體系來實現(xiàn)；無論是何種反應體系中，均以銅基催化劑為主，尤其是銅-鉻催化劑最為常用(ACS Catal.2016,6,7621)。然而，銅-鉻催化劑中的鉻具有高毒性，因此產(chǎn)生了嚴重的環(huán)境問題。盡管近年來糠醛化學催化加氫已取得了長足的發(fā)展和進步，但仍以金屬催化劑為主，并且需要高溫高壓，故化學法仍存在環(huán)境不友好、反應條件苛刻、選擇性不佳、催化劑易失活等問題(Energy Environ.Sci.2016,9,1144)。近年來，生物催化由于具有反應條件溫和、選擇性高、環(huán)境友好等特點，無論是在學術界還是在工業(yè)界都受到了廣泛的關注。

然而，與化學法相比，生物催化糠醛還原合成糠醇研究仍處于起步階段，仍存在諸多問題。此外，糠醛對微生物具有強的抑制和毒性作用(Bioresour.Technol.2000,74,25)，因此全細胞催化糠醛還原仍頗具挑戰(zhàn)。He等報道了一系列Escherichia coli基因工程重組菌，用于催化糠醛還原制備糠醇(Bioresour.Technol.2017,238,698；Bioresour.Technol.2017,245,841；Appl.Biochem.Biotechnol.2018,185,42；Bioresour.Technol.2018,262,52)。這些工程菌對糠醛的最高耐受度約為200mM，當反應體系中糠醛濃度超過該值時，糠醇的產(chǎn)率急劇下降。盡管重組菌E.coli CCZU-K14能較高效、高選擇性地催化200mM糠醛轉化為糠醇，但是該生物轉化需要添加過量的輔底物(300mM葡萄糖)及輔酶前提物(400mM木糖)方能順利進行，這不僅大大限制了該工藝的經(jīng)濟性和實用性，而且加大了后續(xù)產(chǎn)物分離純化的難度(Bioresour.Technol.2017,238,698)。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高活性、高底物耐受性、易重復利用的固定化生物催化劑；并基于該固定化生物催化劑，提供一種簡單、高效、且高選擇性合成糠醇的方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種糠醇的制備方法，將固定化季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)SC1103用于催化糠醛還原制備糠醇。

所述的制備方法，包括如下步驟：將固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細胞加入含有糠醛和葡萄糖的緩沖液中，進行反應，得到糠醇。

優(yōu)選地，所述固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細胞濃度為20～60mg(細胞濕重)/mL緩沖液。

優(yōu)選地，所述糠醛濃度為50～250mM。

優(yōu)選地，所述固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細胞濃度為30～60mg(細胞濕重)/mL緩沖液，所述糠醛濃度為50～200mM。

優(yōu)選地，所述葡萄糖與糠醛的摩爾比為7:15～1:1。

優(yōu)選地，所述緩沖液為乙酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，所述緩沖液的pH介于5～9。

優(yōu)選地，所述反應條件為：溫度為25～45℃，時間為2～24h，攪拌速度為200r/min。

優(yōu)選地，所述固定化季也蒙畢赤酵母SC1103的制備方法為：將收集的固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細胞按200～600mg/mL(細胞濕重)的濃度與海藻酸鈉溶液混合均勻；然后，用無菌注射器逐滴滴入CaCl2溶液中靜置固化，最后用Tris-HCl緩沖液洗滌即可。

優(yōu)選地，所述季也蒙畢赤酵母SC1103經(jīng)過濃度梯度馴化，所述馴化方法為：將季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入含5mM 5-羥甲基糠醛的液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將該菌懸液接入新鮮的含5mM 5-羥甲基糠醛的液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h；隨后，以2％的接種量將上述菌懸液先后接入含10及15mM 5-羥甲基糠醛的液體培養(yǎng)基中，分別進行馴化；馴化后的菌株保藏于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面；所述液體培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖，其組成為1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

所述酵母活化方法為：將馴化后的季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將該菌懸液接入新鮮酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h，收集菌體細胞。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比，具有如下的優(yōu)點：

1)利用固定化細胞作為催化劑，不僅能克服了化學催化劑環(huán)境不友好的缺點，而且在反應結束后可以通過簡單的過濾回收生物催化劑，既可實現(xiàn)催化劑的重復利用，又易于產(chǎn)物的分離純化。

2)本發(fā)明的固定化生物催化劑對底物具有高耐受性，能高效、高選擇性催化高濃度底物還原合成目標產(chǎn)物，產(chǎn)物時空收率高。

3)本發(fā)明反應過程簡單，易控、條件溫和，活潑的糠醛在反應過程中不易發(fā)生副反應，不僅提高產(chǎn)品品質高、降低了能耗，而且有利于簡化后續(xù)目標產(chǎn)物的分離純化工藝。

本發(fā)明所用季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)SC1103，于2016年3月31日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號：CCTCC NO.M 2016144，該菌株已在公開號為CN106520580A的專利中公開，屬于現(xiàn)有技術。

具體實施方式

通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不局限于實施例。

季也蒙畢赤酵母SC1103馴化與活化：季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入含5mM HMF的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基(1％酵母膏，2％蛋白胨及2％葡萄糖)中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將上述菌懸液接入新鮮的含5mM HMF的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h。隨后，以2％的接種量將上述菌懸液先后接入含10及15mM5-羥甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，采用類似的步驟分別進行馴化。將上述馴化后的季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將上述菌懸液接入新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h，收集菌體細胞。